Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Resumen

Identificación de objetivos microbiana de la inmunidad adaptativa en las enfermedades idiopáticas se puede lograr mediante el uso de la prueba de inmunoensayo enzimático.

Resumen

La inmunidad adaptativa es un componente importante a la limpieza de patógenos intracelulares. La capacidad para detectar y cuantificar estas respuestas en los seres humanos es una herramienta diagnóstica importante. El ensayo de la enzima-inmunoensayo (ELISPOT) está ganando popularidad por su capacidad para identificar la respuesta inmune celular contra antígenos microbianos, incluyendo las poblaciones inmunodeprimidas como las infectadas por el VIH, el trasplante, y el uso de esteroides. Este ensayo tiene la capacidad de cuantificar la respuesta inmune contra antígenos microbianos específicos, así como distinguir si estas respuestas son Th1 o Th2 en el carácter. ELISPOT no se limita a la zona de la inflamación. Es versátil en su capacidad para evaluar la respuesta inmune en la sangre periférica, así como los sitios de participación activa, como lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, y ascitis. La detección de la respuesta inmune contra un antígeno único o múltiple es posible, así como epítopos específicos dentro de las proteínas microbianas. Este ensayo permite la detección de la respuesta inmune con el tiempo, así como las diferencias en los antígenos reconocidos por las células T de acogida. Doble ELISPOT color están disponibles para la detección de la expresión simultánea de dos citoquinas. Las recientes aplicaciones de esta técnica incluyen el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar, así como la investigación de la contribución de los antígenos infecciosas a las enfermedades autoinmunes.

Protocolo

Para el siguiente protocolo, que utilizan las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) en las células de interés. Sin embargo, este protocolo podrá ser utilizado con otros tipos de células. Realizar el ensayo en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril.

Día 1: Preparación de las placas y las células

1. Sacar una placa de ELISPOT y abrirlo en el capó.
2. Lavar la placa 3 veces con 150 ml de 1X PBS utilizando una pipeta multicanal, si está disponible, pipeteado y otra solo es aceptable.
3. Saca un paquete de depósitos y abrirlo en el capó.
4. Añadir 2 mg / mL del anticuerpo de captura anti-humano interferón γ, a 11 mL de PBS 1X. Vortex bien. La transferencia de la mezcla de anticuerpos a un depósito.
5. Colocar 100 L de la solución de revestimiento en cada pocillo con el multicanal.
6. Envuelva el plato en parafina.
7. Colocar la placa en el refrigerador durante la noche. Las placas son buenas para la semana. La regla de oro es que si todavía queda líquido en los pozos, la placa se puede utilizar.

Preparación de células

Si el PBMCs son frescos y luego contar las células e incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO _2. Para PBMC almacenados en nitrógeno líquido, el deshielo de las células es necesario. El protocolo es el siguiente:

1. Descongele el criovial de las células a 37 ° C baño de agua hasta que esté casi completamente descongelado.
2. Inmediatamente resuspender en 5 ml de los medios de comunicación R10.
3. Girar durante 5 minutos a 225 x g.
4. Volver a suspender de nuevo en 5 ml de los medios de comunicación R10 y contar las células viables con azul de tripano.
5. Llevar a la concentración de 2 x 10 ⁶ células / ml en los medios de comunicación R10.
6. Descansar durante la noche a 37 º C con CO2 al _5%.

Día 2: Configurar la Plata

1. Etiqueta de la tapa la placa con el número de muestras de identificación, las condiciones del pozo, y la fecha.
2. Lavar la placa 6 veces con 150 l de PBS estéril 1x con el vertedero y el método de transferencia. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga. Esto podría provocar que los pozos de la placa de color morado.
3. Añadir 100 ml de R20 a cada pocillo.
4. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 hora.
5. Mientras que la placa se está incubando, el recuento de las células que habían descansado durante la noche.
6. Haga girar la suspensión de células a 1500 rpm durante 5 minutos. Se decanta el sobrenadante y resuspender el precipitado para que tenga una concentración final de 1x10 ⁶ células por 1 mL en los medios de comunicación R10.
7. Después de la incubación de 1 hora, retirar el R20 con el vertedero y el método de transferencia. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga.
8. Añadir 100 ml de solución de células (10 ⁵ células) a cada pocillo. Añadir péptidos apropiado y / o los antígenos de los pocillos correspondientes por duplicado. Use una nueva punta cada vez que entra en la solución de péptido de trabajo. Concentración de péptido normal es de 10-40 mg / ml. Desde péptidos varían, cada investigador debe valorar péptidos para obtener resultados óptimos.
9. En los pocillos de control negativo, sólo agregar celdas (sin péptidos)
10. En los pocillos de control positivo, añadir la fitohemaglutinina (PHA, 10 mg / ml, Sigma).
11. Incubar toda la noche a 37 ° C con 5% de CO ₂ (~ 18 horas).

Día 3: El desarrollo de la Plata

1. Lavar la placa 6 veces con 150 l 1XPBS utilizando el método de descarga y transferencia.
2. Añadir 100 ml de PBS en cada pocillo de la placa con la pipeta multicanal.
3. Coloque el plato en el refrigerador durante 15 minutos.
4. Tome la placa de la nevera y colóquelo en la campana de cultivo de tejidos.
5. Prepare la solución de anticuerpos con biotina
   • Añadir 0,5 mg / ml de anticuerpos con biotina (MAB 7-B6-1) a 11ml de PBS.
   • Vortex la solución para mezclar bien.
   • Si planea agregar la solución con una multicanal, se vierte en un depósito.
6. Deseche el PBS accionando a la papelera. Tenga cuidado de no salpicar la placa durante la descarga.
7. Colocar 100 L de la solución en cada pocillo.
8. Se incuba la placa en la capilla de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante una hora.
9. Se lava la placa 6 veces con 150μL 1XPBS utilizando el método de descarga y transferencia. En el lavado de 6 ^º, salir de la PBS en el plato hasta que haya preparado el anticuerpo estreptavidina.
10. Prepare el anticuerpo estreptavidina.
    • Añadir 5,5 μ l estreptavidina anticuerpos (estreptavidina-fosfatasa alcalina) de 11ml de PBS (dilución 1:2000).
    • Vortex la solución para mezclar bien.
    • Si planea agregar la solución con una multicanal, se vierte en un depósito.
11. Deseche el resto de PBS en los pocillos y secar la placa.
12. Añadir 100 ml de la solución de estreptavidina a cada pocillo.
13. Se incuba la placa en la capilla de cultivo de tejidos a temperatura ambiente durante 1 hora.
14. Lavar las placas 6 veces con PBS utilizando el método de descarga y transferencia. En el lavado de 6 ^º, salir de la PBS en el plato hasta que haya hecho la solución de color.
15. Trabajar en la oscuridad. Prepare la solución de sustrato de fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina sustrato Kit IV BCIP / NBT):
    • Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato 1 a 11 ml de tampón Tris, vórtice bien. Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato de 2 a Tris, vórtice bien. Añadir 4 gotas de reactivo de sustrato de 3 a Tris, vórtice bien.
16. Deseche el resto de PBS y secar la placa.
17. Añadir 100 ml de la solución de color a cada pocillo de la placa con el multicanal.
18. Encienda la luz después de 5 a 10 minutos de color en desarrollo.
19. Dejar que los reactivos de color de permanecer en el plato hasta que las manchas comienzan a volverse púrpura y son bastante oscuras. Esto debe tomar entre 5 y 20 minutos. Tenga cuidado de no dejar la solución del sustrato en mucho tiempo, ya que hacerlo podría causar ruido de fondo alto.
20. Lavar la placa ELISPOT 3 veces con agua del grifo.
21. Dejar secar por una hora o toda la noche.
22. Lea la placa de forma manual o con lector de placas ELISPOT.
23. Guarde la placa en una caja lejos de la luz.

Los resultados representativos:

ELISPOT está diseñado para cuantificar la respuesta inmune contra los antígenos microbianos. Cada punto indica una célula de respuesta único, que expresa la citoquina de interés. Las manchas pueden ser contados manualmente o con un lector de placas ELISPOT.

Evaluación que el ELISPOT se ha realizado correctamente debe comenzar con la investigación del control negativo para la producción de la citoquina de fondo de interés. En los pozos de control negativo se podría esperar para ver sin puntos, aunque un poco de fondo (color morado) pueden estar presentes. Por lo general, no debe ser inferior a un promedio de cinco puntos por cada pozo. El control de los pozos positivos confirman que la reacción se ha realizado correctamente, y que las células responden a la estimulación antigénica. En los pocillos de control positivo que se puede esperar para ver un fondo de color morado oscuro, debido a una confluencia de puntos (Fig. 1). Debe haber poco o ningún fondo blanco. Si el control positivo y las muestras de control negativo son adecuados, uno puede contar con los pozos que contienen el antígeno de interés. A "subóptima" resultado sería reflejada por el fondo de alto (los pozos son de color púrpura), sin manchas o puntos muy pocos, el centro en blanco, puntos mal definidos o manchas confluentes. Una lista de consejos para solucionar problemas es siempre (Tabla 1).

Figura 1. Un representante de la placa de ELISPOT. Cada plato debe contener un control positivo, control negativo y el péptido de interés llevado a cabo en el mínimo de dos pozos. C9, C10, D9 y D10 son los pocillos de control positivo, como se puede ver que hay un profundo color púrpura, las células confluentes y casi ningún fondo blanco. Los pozos de control negativo son G11, G12, H11 y H12. Estos pozos no tienen fondo morado y sin manchas como se esperaba. Los puntos del G7, el G8, H7 y H8, ilustran las respuestas celulares a péptidos microbianos, los puntos púrpura representan una sola célula que expresa la respuesta de citoquinas de interés.

Tabla 1

Observación	Problema Posible	Solución posible
De fondo de alta	1. Ambos lados de la membrana no se lava correctamente 2. Demasiadas células secretoras de citoquinas 3. Placa no se seca correctamente 4. Sobre la placa de desarrollo	1. Lave ambos lados de la membrana con agua destilada antes y después del desarrollo del color. Los reactivos pueden filtrarse a través de la membrana en la base de la placa, y estas pueden causar ruido de fondo alto si no se enjuaga. 2. Reducir el número de células por pozo, para ello será necesario la optimización 3. Secar la placa ya antes de leer 4. Reducir el tiempo de desarrollo
Sin manchas / manchas muy pocos	1. No hay suficientes células secretoras de citoquinas / proteína de interés 2. Asegúrese de que las células son estimuladas correctamente 3. Las células no se incubaron durante long suficiente o puede tomar un tiempo para responder a los estimulantes 4. El desarrollo del color inadecuado 5. Anticuerpos no lo suficiente como primarios o secundarios	1. Aumentar el número de células. Para ello será necesario la optimización 2. También utiliza un control de estímulos positivos - un estimulante que sabe que inducen la expresión de su citoquinas / proteína de interés 3. Aumentar el tiempo de incubación de células o el uso del método indirecto (pre-tratamiento de las células con estimulantes) 4. Monitorear el desarrollo de color con un microscopio de los gastos generales y garantizar que los reactivos en desarrollo han sido almacenados correctamente y no han perdido la actividad 5. La concentración del anticuerpo primario y / o secundaria será necesario un aumento. Para ello será necesario la optimización.
Las áreas en blanco	1. Membrana no tratados previamente 2. La membrana se ha secado en algún momento 3. Células distribuidas de manera desigual	1. Asegúrese de que la membrana está adecuadamente tratados previamente con etanol al 70% (todas las membranas no es necesario esto para que consulte con su proveedor). Lavar bien con PBS 3 veces después 2. Asegúrese de que la membrana no se seca 3. Asegúrese de mezclar las células con cuidado para tener una buena suspensión celulares homólogos antes de pipetear a cabo en los pozos
Centro de blanco	1. Los daños causados ​​por el lavado	1. Velocidad de flujo en la lavadora automática (o pipeta) puede ser demasiado alto. Necesidad de un procedimiento de lavado más suave
Falsos Positivos	1. Agregados secundaria de anticuerpos 2. Las células todavía en la membrana 3. La contaminación de células cultura	1. Filtro de la secundaria de anticuerpos 2. Asegúrese de que todos se lavan las células de la membrana con PBS Tween 20 antes de la incubación del anticuerpo secundario. Las células de la izquierda en la membrana se dan en forma de manchas irregulares 3. Mantenga los reactivos como estéril y limpia como sea posible. Asegúrese de que su técnica de cultivo celular es aséptico. Compruebe que los falsos positivos mediante la ejecución de un control de los medios de comunicación negativa. De movimiento de las placas, ver los puntos mal definidos
Las manchas confluentes	1. Revestimiento de los pobres, los anticuerpos demasiado 2. Cultivo celular prolongada 3. Células sobre-estimulado	1. Reducir la concentración del anticuerpo primario 2. Cuanto más tiempo se incuban las células, más citoquinas / proteínas que se secretan. Esto se traducirá en grandes manchas que comienzan a fusionarse y se vuelven indistinguibles. 3. Reducir el cultivo de células de paso el tiempo de incubación. La sobre-estimulación se traducirá en una gran cantidad de citoquinas / proteína secretada por la célula. Esto producirá manchas que comienzan a fusionarse y se vuelven indistinguibles. Reducir la cantidad de estimulantes en los medios de cultivo o de la cultura para un corto período de tiempo
Puntos mal definidos	1. Membrana no tratados previamente (si la membrana requiere de esto, consulte con el proveedor) 2. Placa de movimiento durante la incubación de células	1. La membrana debe ser pre-tratados con etanol o esto puede resultar en manchas difusas, mal definidas. Será difícil para el lector para distinguir estos 2. No permita que la placa se mueva durante la incubación de células como las células que se han movido a crear más de un punto. Si es posible utilizar una incubadora dedicada que no se abran durante la incubación. No toque la placa después de la adición de las células
Positivos de control de los pozos es baja	1. Subdesarrollo - puede ser un resultado del uso de estreptavidina-fosfatasa alcalina y / o soluciones BCIP / NBT que no han sido llevados a la temperatura ambiente	1. Llevar los reactivos a temperatura ambiente antes de añadir a los pozos
La densidad de los puntos hace que sea difícil cuantificarlos	1. Muchas células se han añadido a los pozos	1. Hacer diluciones de las células (es decir, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 células por pozo) para determinar el número óptimo de las células que darán lugar a la formación de manchas de distintos

Discusión

El ensayo de ELISPOT se ha convertido en uno de los ensayos más importantes y ampliamente utilizado para controlar las respuestas inmunitarias en el ser humano y una variedad de otras especies. Con el ensayo de ELISPOT, las frecuencias de las células inmunitarias se puede medir a nivel celular individual sin la expansión o la manipulación de las poblaciones de células. ELISPOT se ha aplicado ampliamente para investigar antígeno de respuestas inmunes específicas en varias enfermedades, incluyendo infecciones, cáncer, ale...

Materiales