Artículo de método

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

DOI:

10.3791/2221

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23 de noviembre de 2010

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1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Identificación de objetivos microbiana de la inmunidad adaptativa en las enfermedades idiopáticas se puede lograr mediante el uso de la prueba de inmunoensayo enzimático.

Resumen

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La inmunidad adaptativa es un componente importante a la limpieza de patógenos intracelulares. La capacidad para detectar y cuantificar estas respuestas en los seres humanos es una herramienta diagnóstica importante. El ensayo de la enzima-inmunoensayo (ELISPOT) está ganando popularidad por su capacidad para identificar la respuesta inmune celular contra antígenos microbianos, incluyendo las poblaciones inmunodeprimidas como las infectadas por el VIH, el trasplante, y el uso de esteroides. Este ensayo tiene la capacidad de cuantificar la respuesta inmune contra antígenos microbianos específicos, así como distinguir si estas respuestas son Th1 o Th2 en el carácter. ELISPOT no se limita a la zona de la inflamación. Es versátil en su capacidad para evaluar la respuesta inmune en la sangre periférica, así como los sitios de participación activa, como lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, y ascitis. La detección de la respuesta inmune contra un antígeno único o múltiple es posible, así como epítopos específicos dentro de las proteínas microbianas. Este ensayo permite la detección de la respuesta inmune con el tiempo, así como las diferencias en los antígenos reconocidos por las células T de acogida. Doble ELISPOT color están disponibles para la detección de la expresión simultánea de dos citoquinas. Las recientes aplicaciones de esta técnica incluyen el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar, así como la investigación de la contribución de los antígenos infecciosas a las enfermedades autoinmunes.

Protocolo

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Para el siguiente protocolo, que utilizan las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) en las células de interés. Sin embargo, este protocolo podrá ser utilizado con otros tipos de células. Realizar el ensayo en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril.

Día 1: Preparación de las placas y las células

  1. Sacar una placa de ELISPOT y abrirlo en el capó.
  2. Lavar la placa 3 veces con 150 ml de 1X PBS utilizando una pipeta multicanal, si está disponible, pipeteado y otra solo es aceptable.
  3. Saca un paquete de depósitos y abrirlo en el capó.
  4. Añadir 2 mg / mL del....

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Discusión

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El ensayo de ELISPOT se ha convertido en uno de los ensayos más importantes y ampliamente utilizado para controlar las respuestas inmunitarias en el ser humano y una variedad de otras especies. Con el ensayo de ELISPOT, las frecuencias de las células inmunitarias se puede medir a nivel celular individual sin la expansión o la manipulación de las poblaciones de células. ELISPOT se ha aplicado ampliamente para investigar antígeno de respuestas inmunes específicas en varias enfermedades, incluyendo infecciones, cáncer, ale.......

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Apoyado en parte por Vanderbilt CTSA conceder una UL1 RR024975 del Centro Nacional para Recursos de Investigación, Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo fue financiado por el NIH R01 HL 83839, R01 IA 65744.

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Materiales

A. Preparación de los medios de comunicación

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B. Preparación de Tris Buffer

  1. Añadir 800 ml de ddH2O de vaso de 1 litro.
  2. Medida 12 gramos de Tris y añadir a la jarra.
  3. Añadir 0,12 gramos de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl 2: 6H 2 O) en el vaso.
  4. Remover con la varilla de agitación magnética en la placa de agitación automática.
  5. Una vez disuelto, el pH de la solución a 9,5.
  6. Añadir 200 ml de ddH2O al vaso, con lo que hasta 1000 ml.
  7. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 micras.

C. necesarios para el análisis ELISPOT Materiales:

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Referencias

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  1. Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis. Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).
  2. Sung, H. K. E.

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Etiquetas

ELISPOT AssayT Cell ResponseMicrobial AntigensCytokine DetectionSpot Forming UnitsCapture AntibodyDetection AntibodyPeripheral Blood Mononuclear CellsAlkaline Phosphatase SubstrateDual Color ELISPOT

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