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Inducción y control de enfermedades crónico-recurrente de EAE
La emulsión es una mezcla de 1:1 de antígeno en solución acuosa añadido a complementarse adyuvante completo de Freund. Es muy importante añadir el antígeno al adyuvante y no al revés!
Hay una gran cantidad de residuos y la hora de hacer la inyección de una emulsión. Siempre prepare 1,5 o 2 veces más de lo que usted necesita.
El uso de mortero en autoclave, maja, jeringas de vidrio, y los puentes. Todos los plásticos deben ser estériles. La preparación se puede hacer en una mesa de laboratorio periódicas.
1. Preparación de la coadyuvante complementado
Pesar 30 mg de Mycobacterium tuberculosis (Difco Catálogo # 231141) y ponerlo en un mortero. Convertirlo en polvo fino, sin presionar demasiado para no romper las bacterias. Añadir 10 ml de adyuvante completo de Freund H37Ra (Difco Catálogo # 231131) y mezclar. Este adyuvante complementado ahora contiene 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis. Transferir a un tubo.
2. Preparación del homogenado de médula espinal
Recoger la médula espinal de ratas DA (edad / sexo no importa) y almacenar congelados a -80 ° C. Pesar la médula espinal congelados para tener suficiente para mezclar 1:1 (peso: volumen) con el adyuvante complementado. Picar la médula espinal tan fina como sea posible con una hoja de afeitar, la transferencia del mortero utilizado en la sección 1, y hacer una pasta con la mano del mortero.
3. Preparación de la emulsión
- Lugar complementado adyuvante completo de Freund en un tubo. Vortex a alta velocidad. Añadir la caída de la médula espinal homogenado a gota y agitación. Cuando todos los homogeneizado de la médula espinal, se añade, vortex por 5 minutos más. La mezcla se debe a su vez de color rosa claro.
- Ponga la emulsión en una jeringa de 5 ml de vidrio y vincularlo a otra jeringa de vidrio de 5 ml con un puente 18G (catálogo Fisher º 14-825-17L). Enviar la emulsión con una jeringa a otra hasta que se vuelve difícil (5-10 min). Si hay más de 5 ml de la emulsión se prepara, use varias jeringas de 5 ml NO utilice jeringas más grandes.
- La emulsión puede ser almacenada en las jeringas a 4 ° C durante 3 semanas. Recomiendo la preparación de por lo menos 12 horas de anticipación para verificar que no se descompone. Debe permanecer espesa y no por separado en dos fases. El color va a cambiar durante la noche para una luz de color amarillo o beige.
4. La inmunización de las ratas
- Mezcla de la emulsión en las jeringas durante unos minutos y traslado a la jeringa utilizada para la inyección. Inyectar 200 l por vía subcutánea en la base misma de la cola el uso de agujas 23G y jeringas de 3 ml Luer-Lock a corto plazo con la anestesia.
- Los beneficiarios son las 7-9 semanas de edad las ratas hembras DA. Tenemos nuestras ratas de Harlan Sprague Dawley.
- Las ratas deben ser observadas dos veces al día y pesados diariamente. Los signos clínicos se espera 7-15 días después de la inyección de la emulsión.
Puntuación clínica:
0: sin enfermedad
0.5: cojera cola distal
1: la cola cojera
2: paraparesia leve, ataxia
3: paraparesia moderada, los viajes de las ratas de vez en cuando
3.5: una pata trasera está paralizado, el otro se mueve
4: parálisis completa las extremidades posteriores
5: parálisis completa las extremidades posteriores y la incontinencia
6: respiración moribunda, la dificultad, no comer ni beber. La eutanasia de inmediato.