A gran escala basado en pez cebra En vivo Pantalla de moléculas pequeñas

Resumen

Pez cebra se ha convertido en un poderoso In vivo Plataforma para las pantallas de drogas basada en el fenotipo y el análisis químico genético. Aquí, demostramos un método sencillo y práctico a gran escala de detección de moléculas pequeñas con embriones de pez cebra.

Resumen

Debido a su tamaño pequeño embrión, el rápido desarrollo, la transparencia, la fecundidad, y numerosas similitudes moleculares, morfológicas y fisiológicas de los mamíferos, el pez cebra se ha convertido en un poderoso

Protocolo

1) la recolección de huevos de pez cebra

1. En la tarde antes del día de la pantalla químicos, creado desde 10 hasta 20 tanques de cría de pez cebra. Llenar cada tanque con agua del sistema de la acuicultura. Utilizando una red de pesca, la transferencia de un macho adulto y uno o dos hembras adultas en el recipiente interior de cada tanque de cría. Separar los peces machos y hembras de unos a otros con un divisor. Etiqueta de las jaulas y poner una tapa sobre ellos.
2. En la mañana de la pantalla, quitar los separadores de los tanques de cría y permitir que el pez cebra para el apareamiento. En el transcurso del próximo 1 hora, permiten a los óvulos f....

Discusión

Cuando se planifica una pantalla de química basada en el pez cebra, se debe prestar especial atención a la solidez del fenotipo en estudio y la tasa previa de tal fenotipo. Esto es particularmente importante para las pantallas de los supresores de química de un fenotipo inducido. Por ejemplo, para un fenotipo causado por la inducción de choque térmico de un transgén, la condición que induce el fenotipo debe ser reproducible con precisión trazado antes de iniciar la pantalla para evitar inaceptablemente altos índices de .......

Materiales

1. Mínimo de 20 parejas de adultos de pez cebra de genotipo deseado.
2. Redes de pesca, los tanques de cría, con el recipiente interior extraíble y separadores (hábitats acuáticos).
3. Placas de Petri (10 cm).
4. Colador de plástico.
5. Lavado de botellas de agua contendo embrión.
6. Pipetas desechables de polietileno de transferencia.
7. Poliestireno de 96 pocillos de fondo redondo de las placas de ensayo (Corning Costar, Lowell, MA).
8. Vidrio pipeta Pasteur (Fisher Scientific).
9. Manual pipeta bomba, 10 ml (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
10. Medio embrión E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl _2, 0,33 mM MgSO _4, que contiene 0,003% PTU (feniltio-carbamida, Sigma, St. Louis, MO). PTU se puede preparar como una solución de 10 veces por disolución de 0,3 g PTU en 1 litro de los medios de comunicación embrión E3. Las soluciones que contienen PTU debe ser protegido de la luz cubriendo con papel de aluminio.
11. 12 canales de pipetas, 20.2 l (Eppendorf).
12. 12 canales de pipetas, 300-300 l (Eppendorf).
13. Desechables de poliestireno pipeta de la cuenca, 50 mL (Fisher Scientific).
14. Biblioteca de moléculas pequeñas de compuestos estructuralmente diferentes dispuestos en un formato de 96 wll en acciones 10 mM en DMSO. Cada placa principal se dividió en alícuotas en placas de 96 pozos de almacenamiento de polipropileno (Corning) y se almacenan a -80 ° C hasta su uso.
15. Aluminio cinta aislante para placas de 96 pocillos (Nunc, Rochester, NY).
16. DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
17. Básicos incubadora, 28,5 ° C (Fisher Scientific).
18. Estereomicroscopio con la base de luz transmitida (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).