Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Resumen

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan en Oocitos de Xenopus Mediante la inyección de ARN mensajero. La solución intracelular durante las grabaciones de patch clamp es controlado por un sistema de perfusión.

Resumen

El protocolo que aquí se presenta está diseñado para estudiar la activación de la gran conductancia, el voltaje y Ca ^{2 +-K +} activado (BK) canales. El protocolo también puede ser usado para estudiar la relación estructura-función de otros canales iónicos y receptores de los neurotransmisores ^1. Canales BK se expresan ampliamente en diferentes tejidos y se han implicado en muchas funciones fisiológicas, incluyendo la regulación de la contracción del músculo liso, Ajuste de la frecuencia de las células ciliadas internas y la regulación de la liberación de neurotransmisores ^2-6. Canales BK son activados por despolarización de la membrana y por intracelular de Ca ^{2 +} y Mg ^{2 + 9.6.} Por lo tanto, el protocolo está diseñado para controlar tanto el voltaje de la membrana y la solución intracelular. En este protocolo, el ARN mensajero de los canales BK se inyecta en ovocitos de Xenopus laevis (fase V-VI), seguido de 2-5 días de incubación a 18 ° C ^10-13. Parches de membrana que contienen canales BK uno o varios son extirpados con la configuración de adentro hacia afuera utilizando técnicas de patch clamp ^10-13. La parte intracelular del parche es perfundidos con soluciones deseadas durante la grabación para que la activación del canal en condiciones diferentes pueden ser examinados. En resumen, el ARNm de los canales BK se inyecta en ovocitos de Xenopus laevis que expresan proteínas de canales en la membrana del ovocito, las técnicas de patch clamp se utilizan para registrar las corrientes que fluyen a través de los canales de bajo voltaje controlado y soluciones intracelulares.

Protocolo

1. La inyección de ARNm en los oocitos

1. Inyectar 0,05 a 50 ng de ARN mensajero que se transcribe in vitro en ovocitos de Xenopus laevis (fase V-VI) con Nanoject II Auto-Inyector nanolitros (Drummond Scientific Company, modelo 3-000-204). Repetir la inyección en una docena de ovocitos de cada ARNm.
2. Enjuague los ovocitos inyectados dos veces con solución de ND-96 (96 mM de cloruro de sodio (NaCl, el Sr. 58,44 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl, el Sr. 74,56 g / mol), 1,8 mM de cloruro de calcio (CaCl ₂ • 2H ₂ O , el Sr. 147.02), 1 mM de cloruro de magnesio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, el Sr. 203,31 g / mol), 5 mm 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, el Sr. 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato de sodio (Sr. 110,04 g / mol), y 1 de penicilina-estreptomicina. pH 7,6), y luego colocarlos en una placa de cultivo y se incuba a 18 ° C durante 2 días +.

2. Preparación del sistema de perfusión

Ilustración del sistema de Automatización de ValveLink perfusión 16. El sistema de perfusión utiliza nitrógeno a presión para empujar las soluciones de perfusión de los embalses de solución, a través de los tubos de perfusión, y el lápiz de perfusión y la propina. El flujo de cada flujo de solución de perfusión es controlada por la válvula de un depósito y una válvula electrónica. En este protocolo, uno de los reservorios no está presurizado, y funciona como un recolector de residuos, así como un mecanismo de liberación de presión. (Imagen adaptada de http://www.autom8.com sitio web del proveedor)

1. Conectar los tubos para el lápiz de perfusión. Encienda el controlador de la válvula electrónica y abrir las válvulas electrónicas.
2. Para asegurar que los tubos y el lápiz de la perfusión es libre de burbujas y tapar el aire, empuje desionizada (DI) a través de cada tubo con una jeringa llena de agua desionizada.
3. Conectar los tubos a los depósitos de solución y abrir la válvula del cilindro de gas a aplicar nitrógeno a presión.
4. Abra la válvula del depósito para llenar la tubería con una solución de reserva. Flick de la válvula de reservorio para eliminar las burbujas en la solución si es necesario. Cierre la válvula después de que el tubo se llena con la solución.
5. Llenar la punta de perfusión con agua y apriete los tornillos en el lápiz de la perfusión. Tenga cuidado de no atrapar las burbujas cuando se conecta la punta.
6. Fijar el lápiz de perfusión a la etapa de baño usando arcilla. Asegúrese de que la punta de la perfusión en el espacio de baño. El sistema de perfusión ya está configurado.
7. Añadir agua desionizada en el baño. Asegúrese de que la punta de la perfusión se sumerge en el agua.
8. Prueba de que cada solución de perfusión que sale de la punta de la perfusión correctamente. Cierre la válvula electrónica conectada a la tubería del colector de residuos y abrir la válvula para la solución de perfusión de uno en uno (140 mM de hidróxido de potasio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mM de 4 - (2-hidroxietil) -1 - piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl, M _r 74,56 g / mol), 1 mM de etilenglicol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraacético (EGTA, M _r 380,35 g / mol), se ajusta el pH a 7,1-7,2 por ácido metanosulfónico (MESO _3, M _r 96,1 g / mol), Ca ^{2 +} o Mg2 + se suma a la concentración deseada cuando sea necesario). Bajo el microscopio, observar el chorro de líquido de perfusión que sale de la punta de la perfusión. Cierre la válvula de solución de perfusión y abrir la válvula para el recolector. El chorro de la perfusión debe casi desaparecer. Repita la misma prueba para todas las soluciones para infusión.
9. Cuando haya verificado que todas las soluciones de flujo de perfusión correctamente, reemplace el agua DI en el baño con una solución de baño (140 mM de hidróxido de potasio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl, M _r 74,56 g / mol), se ajusta el pH a 7,1-7,2 por ácido metanosulfónico (MESO _3, M _r 96,1 g / mol)).

3. Patch clamp

1. Recubrir el electrodo de registro Ag con AgCl antes de cada sesión de patch clamp. En primer lugar, quitar el cable del electrodo del titular de la pipeta y sumergir la media punta de la aguja electrodo en un frasco que contiene lejía fresca durante al menos 15 minutos. Esto deposita una capa de AgCl en el cable.
2. Enjuague el alambre del electrodo con agua destilada y secar. Luego de instalar el electrodo de Ag / AgCl de nuevo en el soporte de la pipeta.
3. Conecte el baño (de referencia) del electrodo a la headstage y colocarlo en el baño. Esto prepara a los electrodos para la grabación.
4. Ahora a prepararse para la adquisición de datos. Encienda el ordenador y conectar la llave de hardware en el puerto de impresora de su ordenador. La llave de hardware debe estar conectado para poder utilizar el software de adquisición de datos, que es HEKA pulso.
5. Encienda el amplificador (Axon Instruments, artefactos explosivos abandonadosPARCHE 200B) y empezar a HEKA pulso. Cargar el archivo de protocolo y los ajustes de configuración, como la Escala de estímulo. El objetivo para el ajuste de los parámetros de configuración es asegurar que el potencial de la prueba es exactamente igual a la capacidad de mando. Esto prepara el equipo de adquisición de datos.
6. Prepare los ovocitos. Sumerja el ovocito en la solución de extracción (200 mM de N-metil-D-glucamina (NMG, M _r 195,22 g / mol), 200 mM aspartato (no K ⁺⁾ (M _r 133,1 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl , M _r 74,56 g / mol), 10 mM de etilenglicol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA, M _r 380,35 g / mol), 1 mM de cloruro de magnesio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, M _r 203,31 g / mol), 10 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), se ajusta el pH a 7,4 con hidróxido de sodio (NaOH, M _r 40,0 g / mol) de 5 - 10 min. La solución de extracción se separa la membrana vitelina de la membrana plasmática que permite despojar a la membrana vitelina.
7. Suavemente tira de la membrana vitelina del ovocito utilizando dos pares de pinzas. Un ovocito devitellinized es extremadamente frágil y, por tanto, moverse tan poco como sea necesario.
8. Teniendo cuidado de evitar la exposición de los ovocitos devitellinized de aire o burbujas, utilizar una pipeta de vidrio llena con una solución suficiente para transferir el óvulo de la bañera. Esto prepara al ovocito para la grabación.
9. Prepare pipetas parche. Tire de la pipetas de vidrio después de la inserción de un tubo capilar de vidrio (VWR International, Cat # 53432 a 921) en un Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipeta extractor. Observe las pipetas bajo el microscopio para determinar la forma de la punta y el diámetro de apertura. El diámetro de la abertura debe ser 4.2 micrómetros.
10. Para reducir la corriente capacitiva durante la grabación y para asegurar una punta suave, cubra la punta con cera y luego el fuego de uñas.
11. Llenar la pipeta mediante la colocación de la punta de la pipeta dentro de la solución de la pipeta (140 mM de hidróxido de potasio (KOH, M _r 56,1 g / mol), 20 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M _r 238,31 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl, M _r 74,56 g / mol), 2 mM de cloruro de magnesio (MgCl ₂ • 6H ₂ O, M _r 203,31 g / mol), se ajusta el pH a 7,1-7,2 por metano ácido (MESO _3, M _r 96,1 g / mol)) y el dibujo del émbolo. Este moja la punta.
12. Llenar la pipeta 1 / 3 del total con una solución de pipeta con una jeringa y coloque la pipeta en el soporte de la pipeta con el interior del electrodo Ag / AgCl y el contacto con la solución de la pipeta. Esto prepara el parche pipeta.
13. Para extirpar un parche de dentro a fuera de los ovocitos preparados, encuentre la clara ventaja de los ovocitos bajo el microscopio. Mueva el parche pipeta cerca del ovocito utilizando manipulador. Registrar la resistencia de serie de la pipeta. La resistencia en serie ideal de la pipeta parche está entre 1-1.5 mW cuando se llena con solución de la pipeta y se sumergen en una solución de baño.
14. Vuelva a introducir con la pipeta contra el ovocito hasta que la resistencia se duplica.
15. Aplicar succión suave a la membrana por vía oral a través de un tubo de aspiración que está conectado al titular de la pipeta hasta que un sello de giga-ohm se obtiene. Estabilizar el parche mediante la celebración de la tensión en mV -30 para un par de minutos.
16. Para obtener un parche de adentro hacia fuera, los impuestos especiales por el parche rápidamente empujando aún más la pipeta en el ovocito y luego tirando de él hacia fuera.
17. El parche de adentro hacia afuera ya está listo para la sujeción. Mueva la pipeta de sujeción del parche de adentro hacia fuera a cerca de 100 micras de distancia de la abertura de la punta de la perfusión.
18. Cierre la válvula electrónica de recogida de residuos y abra la válvula de reservorio para la solución de perfusión deseado
19. Comenzar a grabar las corrientes a través del parche. Cambiar las soluciones de tensión y de la perfusión como se desee.
20. Cuando haya terminado de grabar, limpie la perfusión de tubos, lápiz y punta empujando a través de agua destilada para evitar obstrucciones.

4. Resultados representante

Durante la preparación de los oocitos de patch clamp, el tratamiento de 5-10 minutos de la solución de extracción se separan de la membrana vitelina de la membrana plasmática, lo que hace posible extracción de la membrana vitelina.

La resistencia en serie ideal de la pipeta parche está entre 1-1.5 mW cuando se llena con solución de la pipeta y se sumergen en una solución de baño.

A continuación se presenta un registro representativo de tipo salvaje canales BK en un parche de membrana del ovocito. En la parte superior izquierda, las ondas cuadradas indican el voltaje aplicado a la mancha - el segundo paso de los aumentos de voltaje de 50 mV a 200 mV con un incremento de 50 mV. A continuación se muestra las huellas correspondientes actual cuando la solución de perfusión ha nominal 0 Ca ^{2 +} (libre [Ca ^{2 +]} es de aproximadamente 0,5 nM). Enaumento de la amplitud de la corriente indica que la probabilidad de abrir los canales BK de los incrementos de voltaje. En el lado derecho, el mismo parche es perfundidos con 1,0 M de Ca ^{2 +} cuando se aplica con el protocolo mismo voltaje. La amplitud de la corriente se incrementa más en el mismo voltaje, lo que indica que la probabilidad aumenta con la abierta [Ca ^{2 +].}

Discusión

El sistema de expresión de ovocitos es ideal para la caracterización electrofisiológica de los canales iónicos dependientes de voltaje debido a la relativamente baja de fondo de los canales endógenos. Además, dado que se trata de un sistema de expresión transitoria, que proporciona un método eficiente de llevar a cabo el estudio de mutagénesis de estos canales. Sin embargo, cabe señalar que el sistema de expresión de los ovocitos es diferente de la de células de mamíferos, por lo tanto puede haber diferencias en la modi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Inyector de nanolitros Nanoject II Drummond	Scientific	3-000-204
P-97 Extractor de micropipetas Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97
Sistema de Perfusión y Controlador Electrónico AutoMate Scientific	, Inc.	ValveLink 16	Diámetro interior de la punta de perfusión: 100 micras
Microscopio invertido	Olympus Corporation	CKX31
Pipetas de vidrio	VWR international	53432-921
Extractor de micropipetas Flaming/Brown Sutter	Instrument Co.	P-97
Amplificador	Axon Instruments	AXOPATCH 200B
Interfaz de computadora	INSTRUTECH Corporation	ITC-18
Headstage	Axon Instruments	CV 203BU