Se describe un método simple, rápido y robusto para la formación de Candida albicans Biofilms de 96 placas de microtitulación bien y su utilidad en las pruebas de sensibilidad antifúngica de las células dentro de los biofilms.
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Artículo de método
A 96 de microtitulación y placa basada en el método para la formación de Control y pruebas de sensibilidad antifúngica Candida albicans Las biopelículas
En este artículo
Resumen
Resumen
Candida albicans es la causa más frecuente de las infecciones por hongos en una creciente población de pacientes inmunocomprometidos y la candidiasis es ahora la tercera enfermedad más común en los hospitales de los EE.UU.. Diferentes manifestaciones de la candidiasis se asocia con la formación de biofilm, tanto en los tejidos del huésped y / o dispositivos médicos (catéteres es decir). Formación de biopelículas lleva consecuencias negativas en la clínica, como las células dentro de los biofilms están protegidos de las respuestas inmunitarias del huésped y de la acción de los antifúngicos. Hemos desarrollado un modelo simple, rápido y robusto in vitro para la formación de C. biofilms albicans de 96 y placas microtiter, que también puede ser utilizado para las pruebas de bio-película de sensibilidad antifúngica. La lectura de este ensayo es colorimétrico, basado en la reducción de XTT (una sal de tetrazolio) por las células metabólicamente activas biopelículas fúngicas. Un experimento típico dura aproximadamente 24 horas para la formación de biofilm, con un adicional de 24 horas para las pruebas de sensibilidad antifúngica. Debido a su simplicidad y el uso de materiales de laboratorio comúnmente disponibles y el equipo, esta técnica democratiza la investigación del biofilm y representa un paso importante hacia la normalización de las pruebas de sensibilidad antifúngica de las biopelículas fúngicas.
Protocolo
1. Preparación de C. albicans
C. albicans es un microorganismo del grupo de riesgo 1/BSL1. Recuerde siempre que un buen uso de las técnicas de asepsia / estéril para trabajar con este microorganismo y seguir los procedimientos institucionales para la eliminación apropiada de tales materiales.
- Preparar un cultivo de una noche de C. albicans en YPD (levadura peptona dextrosa) medio líquido mediante la inoculación de una sola colonia de C. albicans en 25 ml de YPD.
- Incubar la cultura en un agitador orbital (180 rpm) a 30 ° C durante la noche. La mayoría de C. albicans cepas cr....
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Discusión
A continuación se describe una forma simple, rápida, económica y altamente reproducible 96 modelo y placa de microtitulación para la formación de biopelículas de Candida, junto con un método colorimétrico que mide la actividad metabólica de las células dentro del biofilm con XTT. Este modelo 96 y placas de microtitulación para la formación de biofilm fue desarrollado originalmente para C. albicans, pero se puede utilizar para otras especies de Candida. y fácilmente adaptable a otros hongos. El.......
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Divulgaciones
JLL-R posee la equidad en las tecnologías de MicrobeHTS, Inc., que es el desarrollo de agentes antifúngicos. Tecnologías MicrobeHTS, Inc. no proporcionó apoyo financiero para estos estudios.
Agradecimientos
Biopelícula relacionadas con el trabajo en el laboratorio es financiado por donaciones y numeradas R21DE017294 R21AI080930 del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (a JLL-R.). El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDCR, el NIAID oa los NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar Sabouraud-dextrosa | BD Biosciences | 211584 | Para preparar placas para subcultivos frescos de aislamientos fúngicos |
| YPD: dextrosa de peptona de levadura | US Biological | Y2076 | Medio para la propagación de cultivos líquidos nocturnos |
| RPMI-1640 sin bicarbonato de sodio suplementado con L-glutamina | Cellgro | 50-020-PB | Medio líquido para la formación de biopelículas |
| Ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | Para tamponar el RPMI 1640 |
| Solución salina tamponada con fosfato, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Tampón para lavados |
| Sal sódica de XTT | Sigma-Aldrich | X4251 | Ver arriba las instrucciones de preparación |
| Lactato de Ringer’s | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | Para la preparación de la solución de XTT |
| Menadiona | Sigma-Aldrich | M5625 | Precaución: peligroso por contacto dérmico, inhalación o ingestión |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Tubos cónicos para centrífuga de 15 ml | Corning | 430790 | |
| Tubos cónicos para centrífuga de 50 ml | Corning | 430828 | |
| Placas de microtitulación de 96 pocillos: de poliestireno, fondo plano, tratadas para cultivo celular | Corning | 3595 | |
| Pipeta multicanal y puntas | Eppendorf | ||
| Incubadora | Cualquier proveedor | ||
| Lector de placas de microtitulación | Cualquier proveedor |
Referencias
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A.
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Reimpresiones y permisos
