Method Article

El análisis de las células madre pluripotentes utilizando criosecciones de cuerpos embrioides

DOI:

10.3791/2344

⸱

December 8th, 2010

 ,  ,  ,  , 
1Laboratório Nacional de Céulas-Tronco Embrionárias (LaNCE), Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brazil

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre pluripotenciales de crecimiento en suspensión se diferencian en cuerpos embrioides (EBS). Aquí se demuestra cómo obtener alta calidad cryosections EB útil para el estudio de los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, mientras que la preservación de su organización en forma de agregados.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Madre embrionarias (ES) son células pluripotentes derivadas de la masa celular interna del blastocisto en fase inicial, los embriones de mamíferos 1. Una etapa crucial en la diferenciación de células madre embrionarias es la formación de cuerpos embrioides (EBS) agregados 2, 3. La formación de EB se basa en la agregación espontánea cuando las células ES se cultivaron en placas no adherente. Tridimensional recapitula EB muchos aspectos de la embriogénesis temprana de mamíferos y se diferencian en las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo 4.

Inmunofluorescencia e hibridación in situ se utilizan mucho las técnicas para la detección de proteínas diana y el ARNm presente en las células de una sección de tejido 5, 6, 7. Aquí presentamos una técnica sencilla para generar cryosections alta calidad de los cuerpos embrioides. Este enfoque se basa en la orientación espacial de la incorporación de EB en octubre seguido por la técnica cryosection. Las secciones resultantes pueden ser objeto de una amplia variedad de procedimientos analíticos para caracterizar las poblaciones de células que contienen ciertas proteínas, ADN o ARN. En este sentido, la preparación de cryosections EB (10μm) son herramientas esenciales para el análisis de la tinción histológica (por ejemplo, hematoxilina y eosina, DAPI), inmunofluorescencia indirecta (por ejemplo, Oct4, nestin) o hibridación in situ. Esta técnica también puede ayudar a comprender aspectos de la embriogénesis en lo que respecta al mantenimiento de la estructura esférica tridimensional de EBS.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. La fijación y criopreservación

Las células madre pluripotentes fueron cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEF) inactivados con mitomicina C y se mantiene en DMEM/F12 complementado con el reemplazo de octavos de final 20% de suero (KSR) y 8ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-2). Con el fin de inducir la formación de EB H9 células fueron transferidas a no adherentes platos y cultivadas durante 7 días, mantenida en DMEM/F12 complementado con un 15% KSR 8.

Nota (!): Esta técnica se puede utilizar para EBs derivadas de cualquier célula pluripotente madre embrionarias e inducidos.

  1. Recoge los EBs de la placa de cultivo con una pipeta.
  2. Transferencia de EBs a un tubo de 15 ml y esperar hasta que el material se hunde al fondo del tubo.
  3. Quitar medio y fijar EBS con un 4% de paraformaldehído (PFA) en la solución de PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    Nota (!): Para la recuperación in situ antígeno hibridación se debe hacer para evitar la reacción de entrecruzamiento con anticuerpos debido a la utilización de la PFA 6,7.
  4. Eliminar la solución de PFA y lavar con PBS durante 5 min.
  5. EBS se debe colocar en serie de dilución de PBS buffer soluciones de sacarosa (10, 20 y 30%, en la secuencia) a 25-28 ° C, cada solución debe ser reemplazado cada 30 minutos. El material puede ser almacenado en la solución de sacarosa al 30% a 4 ° C hasta el paso de la incrustación de octubre

2. Incorporación de los tejidos, Orientación y de congelación

  1. Recoger cuidadosamente el EBS del tubo. Descarga de sacarosa como mucho una solución posible.

    Nota (!): Es importante que se orinan en la pared interna de la extremidad con solución de sacarosa antes de recoger el EBS. Este procedimiento se puede evitar la EB que se adjunta a la punta.
  2. EBs lugar en el molde y retirar la solución restante de sacarosa con papel de filtro.

    Nota (!): Es importante no llenar el molde con EBS para evitar la superposición.
  3. Colocar el molde con octubre lentamente, con cuidado de no volver a suspender EBS. Después de eso, coloque todos los EB en el centro del molde y eliminar las burbujas con la pipeta.
  4. Agitar suavemente durante 15 minutos.
  5. Rodean el molde con hielo picado en seco para congelar la muestra. Octubre debe estar completamente congelado. En este punto, los bloques pueden ser almacenadas a -70 ° C, por lo menos un año.

3. Muestras criostáticas Técnica

  1. Retire el bloque congelado desde -70 ° C y colocarlos en criostato previamente enfriado a una temperatura entre -18 y -21 ° C.

    Nota (!): Las temperaturas fuera de este rango puede causar problemas como secciones curling, fusión o formación de grietas.
  2. Separar el bloque de octubre del molde y se coloca en el soporte del criostato, añadiendo más octubre
  3. Es importante orientar correctamente el bloque y alinearla paralela al borde de la hoja.

    Nota (!): Como EBs son más pequeñas que las muestras de otros tejidos, este paso es muy importante para minimizar la pérdida de material.
  4. Bloques de octubre se debe seccionar superficialmente hasta que el plano de la superficie se obtiene. Secciones delgadas (10μm) de la muestra de tejido se deben tomar y montados en portaobjetos de cristal previamente recubierto de 200 mg / ml de poli L-lisina (10 l por diapositiva) 9,10.

    Nota (!): Para evitar que las secciones torned prestar atención a los daños y perjuicios a la hoja.
  5. Todas las secciones deben ser secadas al aire durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se utilizan o almacenan a -70 ° C hasta su uso.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método descrito aquí proporciona una forma fácil de seguir el protocolo para obtener PFA fijo secciones de criostato delgada de cuerpos embrioides útil para inmunofluorescencia y en los ensayos de hibridación in situ. El cryosections resultante permitirá el estudio de aspectos celulares y moleculares de la madre de embriones humanos diferenciación de células, mientras que preserva su estructura y organización de los agregados.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Amparo un Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) y el Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Estamos muy agradecidos a Bruna S. Paulsen y Aline M. Fernandes para las imágenes EB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D (+) Reactivo de sacarosaVetec228
Reactivode paraformaldehídoRieden-de Haë n16005
Reactivo de solución de PBSLGC Biotecnology13-30259.05
Hidrobromuro de poli-L-lisinaReactivoSigma-AldrichP2636200mg/mL en agua
Tissue-Tek O.C.T. Reactivo compuestoSakura FinetekP2636
Solución de sacarosaReactivo10% Solución de sacarosa en PBS c/v
Reactivosoluciónde sacarosa al 20% Solución de sacarosa en PBS con
solución de sacarosaReactivoal 30% Solución de sacarosa en PBS con
herramienta de tubo cónico Productos tecnoplásticos91015Tubo cónico de 15 ml
Agitador de placasHerramientaBiomixer
Herramienta de criostatoLeica MicrosystemsCM 1850
Molde para plataforma OCTHerramientaPlataforma de molde de plástico
de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
  2. Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, 88-95 (2000).
  3. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).
  4. Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).
  5. Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Cells. 24, 76-82 (2007).
  6. Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).
  7. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).
  8. Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies. Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).
  9. Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating. Histochemistry. 77, 275-279 (1983).
  10. Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats. Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Embryoid BodiesCryosection TechniqueImmunofluorescence AnalysisIn Situ HybridizationEmbryonic Stem CellsOCT EmbeddingSucrose CryoprotectionParaformaldehyde FixationTissue SectioningGerm Layer Differentiation

Related Articles