Las células madre pluripotenciales de crecimiento en suspensión se diferencian en cuerpos embrioides (EBS). Aquí se demuestra cómo obtener alta calidad cryosections EB útil para el estudio de los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, mientras que la preservación de su organización en forma de agregados.
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Artículo de método
El análisis de las células madre pluripotentes utilizando criosecciones de cuerpos embrioides
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Resumen
Resumen
Madre embrionarias (ES) son células pluripotentes derivadas de la masa celular interna del blastocisto en fase inicial, los embriones de mamíferos 1. Una etapa crucial en la diferenciación de células madre embrionarias es la formación de cuerpos embrioides (EBS) agregados 2, 3. La formación de EB se basa en la agregación espontánea cuando las células ES se cultivaron en placas no adherente. Tridimensional recapitula EB muchos aspectos de la embriogénesis temprana de mamíferos y se diferencian en las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo 4.
Inmunofluorescencia e hibridación in situ se utilizan mucho las técnicas para la detección de proteínas diana y el ARNm presente en las células de una sección de tejido 5, 6, 7. Aquí presentamos una técnica sencilla para generar cryosections alta calidad de los cuerpos embrioides. Este enfoque se basa en la orientación espacial de la incorporación de EB en octubre seguido por la técnica cryosection. Las secciones resultantes pueden ser objeto de una amplia variedad de procedimientos analíticos para caracterizar las poblaciones de células que contienen ciertas proteínas, ADN o ARN. En este sentido, la preparación de cryosections EB (10μm) son herramientas esenciales para el análisis de la tinción histológica (por ejemplo, hematoxilina y eosina, DAPI), inmunofluorescencia indirecta (por ejemplo, Oct4, nestin) o hibridación in situ. Esta técnica también puede ayudar a comprender aspectos de la embriogénesis en lo que respecta al mantenimiento de la estructura esférica tridimensional de EBS.
Protocolo
1. La fijación y criopreservación
Las células madre pluripotentes fueron cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEF) inactivados con mitomicina C y se mantiene en DMEM/F12 complementado con el reemplazo de octavos de final 20% de suero (KSR) y 8ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-2). Con el fin de inducir la formación de EB H9 células fueron transferidas a no adherentes platos y cultivadas durante 7 días, mantenida en DMEM/F12 complementado con un 15% KSR 8.
Nota (!): Esta técnica se puede utilizar para EBs derivadas de cualquier célula pluripotente madre embrionarias e inducidos.
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Discusión
El método descrito aquí proporciona una forma fácil de seguir el protocolo para obtener PFA fijo secciones de criostato delgada de cuerpos embrioides útil para inmunofluorescencia y en los ensayos de hibridación in situ. El cryosections resultante permitirá el estudio de aspectos celulares y moleculares de la madre de embriones humanos diferenciación de células, mientras que preserva su estructura y organización de los agregados.
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Amparo un Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) y el Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Estamos muy agradecidos a Bruna S. Paulsen y Aline M. Fernandes para las imágenes EB.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Sacarosa D (+) | Reactivo | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehído | Reactivo | Rieden-de Haën | 16005 | |
| Solución de PBS | Reactivo | LGC Biotecnología | 13-30259.05 | |
| Hidrobromuro de poli-L-lisina | Reactivo | Sigma-Aldrich | P2636 | 200 mg/mL en agua |
| Compuesto Tissue-Tek O.C.T. | Reactivo | Sakura Finetek | P2636 | |
| Solución de sacarosa | Reactivo | Solución de sacarosa al 10 % en PBS p/v | ||
| Solución de sacarosa | Reactivo | Solución de sacarosa al 20 % en PBS p/v | ||
| Solución de sacarosa | Reactivo | Solución de sacarosa al 30 % en PBS p/v | ||
| Tubo cónico | Herramienta | Techno Plastic Products | 91015 | Tubo cónico de 15 mL |
| Agitador de placas | Herramienta | Biomixer | ||
| Criostato | Herramienta | Leica Microsystems | CM 1850 | |
| Molde para plataforma de OCT | Herramienta | Plataforma de molde plástico |
Referencias
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-117 (1998).
- Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N.
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Reimpresiones y permisos
