El análisis de las células madre pluripotentes utilizando criosecciones de cuerpos embrioides

Summary

Las células madre pluripotenciales de crecimiento en suspensión se diferencian en cuerpos embrioides (EBS). Aquí se demuestra cómo obtener alta calidad cryosections EB útil para el estudio de los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, mientras que la preservación de su organización en forma de agregados.

Abstract

Madre embrionarias (ES) son células pluripotentes derivadas de la masa celular interna del blastocisto en fase inicial, los embriones de mamíferos ^1. Una etapa crucial en la diferenciación de células madre embrionarias es la formación de cuerpos embrioides (EBS) agregados ^{2, 3.} La formación de EB se basa en la agregación espontánea cuando las células ES se cultivaron en placas no adherente. Tridimensional recapitula EB muchos aspectos de la embriogénesis temprana de mamíferos y se diferencian en las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo ^4.

Inmunofluorescencia e hibridación in situ se utilizan mucho las técnicas para la detección de proteínas diana y el ARNm presente en las células de una sección de tejido ^{5, 6, 7.} Aquí presentamos una técnica sencilla para generar cryosections alta calidad de los cuerpos embrioides. Este enfoque se basa en la orientación espacial de la incorporación de EB en octubre seguido por la técnica cryosection. Las secciones resultantes pueden ser objeto de una amplia variedad de procedimientos analíticos para caracterizar las poblaciones de células que contienen ciertas proteínas, ADN o ARN. En este sentido, la preparación de cryosections EB (10μm) son herramientas esenciales para el análisis de la tinción histológica (por ejemplo, hematoxilina y eosina, DAPI), inmunofluorescencia indirecta (por ejemplo, Oct4, nestin) o hibridación in situ. Esta técnica también puede ayudar a comprender aspectos de la embriogénesis en lo que respecta al mantenimiento de la estructura esférica tridimensional de EBS.

Protocol

1. La fijación y criopreservación

Las células madre pluripotentes fueron cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEF) inactivados con mitomicina C y se mantiene en DMEM/F12 complementado con el reemplazo de octavos de final 20% de suero (KSR) y 8ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-2). Con el fin de inducir la formación de EB H9 células fueron transferidas a no adherentes platos y cultivadas durante 7 días, mantenida en DMEM/F12 complementado con un 15% KSR ^8.

Nota (!): Esta técnica se puede utilizar para EBs derivadas de cualquier célula pluripotente madre embrionarias e inducidos.

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Discussion

El método descrito aquí proporciona una forma fácil de seguir el protocolo para obtener PFA fijo secciones de criostato delgada de cuerpos embrioides útil para inmunofluorescencia y en los ensayos de hibridación in situ. El cryosections resultante permitirá el estudio de aspectos celulares y moleculares de la madre de embriones humanos diferenciación de células, mientras que preserva su estructura y organización de los agregados.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D (+) Reactivo de sacarosa		Vetec	228
Reactivo	de paraformaldehído	Rieden-de Haë n	16005
Reactivo de solución de PBS		LGC Biotecnology	13-30259.05
Hidrobromuro de poli-L-lisina	Reactivo	Sigma-Aldrich	P2636	200mg/mL en agua
Tissue-Tek O.C.T. Reactivo compuesto		Sakura Finetek	P2636
Solución de sacarosa	Reactivo			10% Solución de sacarosa en PBS c/v
Reactivo			solución	de sacarosa al 20% Solución de sacarosa en PBS con
solución de sacarosa	Reactivo			al 30% Solución de sacarosa en PBS con
herramienta de tubo cónico Productos tecnoplásticos			91015	Tubo cónico de 15 ml
Agitador de placas	Herramienta	Biomixer
Herramienta de criostato		Leica Microsystems	CM 1850
Molde para plataforma OCT	Herramienta			Plataforma de molde de plástico