Implantación de una sonda biocompatible flexible en un modelo de ratón con glioblastoma

Resumen

Fuente: Lefevre, M. C., et al., Dispositivos electrónicos orgánicos flexibles para la terapia de campo eléctrico pulsado del glioblastoma. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra la implantación de una sonda flexible y biocompatible en un modelo de ratón de glioblastoma para administrar una terapia de campo eléctrico pulsado dirigida para aplicaciones neuroterapéuticas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. El modelo in vivo
   NOTA: Los ratones AMU-Neuroinflam fluorescentes multicolores adultos (B6. Se utilizaron Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); estos ratones presentan marcaje de una subpoblación de neuronas Thy1⁺ por expresión transgénica de ECFP, marcaje de células inflamatorias periféricas LyzM⁺ por expresión transgénica de EGFP y marcaje de un subtipo de microglía que expresa EYFP bajo el control de Cd11c⁺. En resumen, los animales son ligeramente sedados con isoflurano al 1,5% durante 2 minutos antes de cualquier tratamiento o inyección. Antes de la cirugía, los animales son anestesiados con ketamina (120 mg/kg; IP) y xilacina (12 mg/kg; IP). Luego, se aplica localmente gel de lidocaína al 3% para aliviar cualquier dolor en los oídos asociado con la fijación del soporte estereotáctico. Luego, se administra una solución de bupivacaína al 0,25% en el sitio quirúrgico para aliviar cualquier dolor debido a la craneotomía. Una vez preparado el ratón para la cirugía, se realizó una craneotomía de 4 mm de diámetro. Con una aguja de 26 G, se hizo un orificio en la duramadre en el medio de la craneotomía y se inyectó el esferoide tumoral con el sistema de inyección. Además, como se describe aquí, se colocó un electrodo flexible en el esferoide tumoral que expresa GCamp6 o DsRed antes de sellar la craneotomía con una ventana de vidrio.
   1. Coloque una gota de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco para que cubra la craneotomía. Coloque el electrodo flexible en la gota de DPBS y coloque suavemente la parte posterior de la sonda con almohadillas de contacto en la parte posterior del mouse (Figura 1B).
      NOTA: Use guantes estériles y una técnica de "solo punta". Cambie los guantes si entra en contacto con una superficie no estéril. Proporcione soporte térmico durante este procedimiento.
   2. Toque la gota de DPBS con un pequeño trozo de papel para absorber DPBS hasta que la sonda pueda quedar plana sobre la duramadre y seguir la curvatura del cerebro. Asegúrese de que una pequeña capa de DPBS permanezca debajo de los electrodos sin escapar por el costado del electrodo. Esto asegura una barrera contra el derrame de pegamento durante los siguientes pasos.
      NOTA: Esterilice todo el equipo antes de usarlo.
   3. Coloque una pequeña gota de adhesivo de silicona sobre la sonda y cúbrala con un cubreobjetos redondo de 5 mm. Empuje el cubreobjetos hacia abajo hasta que la silicona se distribuya uniformemente y la distancia entre el cubreobjetos y la sonda sea mínima. Empuje el cubreobjetos hacia abajo durante otros 30 segundos para que la silicona se solidifique.
   4. Para asegurar la cubierta de vidrio, aplique rápidamente superpegamento en sus lados y empújelo hacia abajo hasta que el pegamento se cure a sólido.
   5. Con un palillo de dientes, aplique superpegamento en el cuello de la sonda, teniendo cuidado de que el superpegamento se coloque debajo del cuello para brindarle un soporte estable.
   6. Cubra el cráneo con cemento dental para construir una tapa crónica. Tenga especial cuidado de cubrir solo los bordes de la cubierta de vidrio.
   7. Levante la parte posterior de la sonda y aplique cemento debajo de su cuello. Apoye la sonda sobre el cemento antes de que se cure. Empuje suavemente hacia abajo el cuello de la sonda con pinzas romas para que su superficie esté al mismo nivel que la del cubreobjetos y no en el camino del objetivo del microscopio durante el experimento.
   8. Cubra la parte superior del cuello de la sonda con no más de 1,5 mm de capa de cemento dental para lograr una sujeción firme de la sonda. Construir un pozo de cemento que presente una cresta de 1,5 mm a una distancia de 1-2 mm alrededor del vidrio de cubierta para crear un recipiente para el fluido de inmersión para la imagen de dos fotones (Figura 1C).
   9. Una vez que el cemento se haya curado, aplique analgésicos posquirúrgicos de buprenorfina (0,05 mg / kg, 0,1 ml por 10 g de peso corporal por vía subcutánea) y mantenga al animal en un ambiente cálido hasta que se despierte. Esto incluye la proximidad a una bombilla de luz infrarroja, así como envolver al animal en una toalla de papel.
      NOTA: Coloque un termómetro al nivel del ratón para controlar la temperatura.
   10. Caracterice la impedancia en el rango de 1-10 kHz utilizando un potenciostato.
   11. Deje que el animal se recupere de la cirugía durante al menos 10 días. Administrar antiinflamatorios inmediatamente después de la cirugía y continuar monitoreando el estado del animal para proporcionar una analgesia postoperatoria adecuada.

Resultados

Figura 1: La aplicación in vivo. (A) Esquema para experimentos in vivo. (B) Colocación de la sonda antes de la aplicación de la cubierta de vidrio y resina acrílica. (C) Implantación de sonda co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Resina acrílica	Fischer scientific NC1455685
Buprenorphine	Axience
Generador
Penicilina / Estreptomicina	Gibco	15140-122
Solución salina de tampón de fosfato	Thermofisher	D8537
Protolaser S	LPKF
Cubierta redonda de 5 mm de diámetro	Fischer scientific	50-949-439
Adhesivo de silicona Kwik-Sil	World Precision Instruments
Super glue	Office depot
U87-MG	ATCC	HTB-14 Células de	glioblastoma humano

de pulsos fabricado en laboratorio