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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.
- Preparación de la jeringa de microinyección y el microinyector para la inyección:
- Bloquee cada jeringa de microinyección hermética al gas en la rejilla de la bomba de microinyección.
- Coloque la punta de la jeringa hermética al gas en el agua estéril contenida en un pequeño bote de pesaje y agite suavemente el émbolo para lubricar el cable interno. Tire uniformemente del émbolo hasta el tope trasero de la bomba para llenarlo de agua.
- Deslice el tubo PE20 que está conectado al microinyector en una aguja de 26 G (cubo marrón) conectada a una jeringa de 1 ml llena de agua estéril. Rocíe agua estéril a través del microinyector e inspeccione el patrón de rociado y la distancia.
NOTA: El agua debe rociarse muy lejos y directamente de la punta del microinyector. Si el chorro no es recto, la ubicación de la inyección no será correcta. - Coloque el microinyector esterilizado en un campo estéril.
- Deslice el tubo fuera de la aguja, manteniendo el tubo del microinyector en posición vertical para evitar que el agua gotee y al mismo tiempo corte el tubo debajo del área dañada por la aguja.
- Empuje el émbolo de la jeringa de microinyección ligeramente hacia adelante para crear una gota en el extremo de la aguja y deslice el tubo de PE20 lleno de agua (que está conectado al microinyector) sobre la aguja.
NOTA: Esto creará una conexión de líquido a líquido que permitirá una contrapresión adecuada que podría desalojar una obstrucción que podría formarse en la punta del microinyector. - Empuje el émbolo completamente hacia adelante para prepararse para la carga de muestras y asegúrese de que no queden trazas de etanol en el microinyector.
- Verifique la configuración en busca de fugas tocando la gota de agua que se ha formado en la punta del microinyector con una toallita de laboratorio limpia varias veces.
- NOTA: Al tocar la toallita de laboratorio, solo se debe formar una mancha húmeda. Si hay más gotas, hay una fuga en el sistema.
- Evite fugas controlando la aplicación de superpegamento y recortando el tubo PE20 con unas tijeras afiladas o una cuchilla de afeitar cada vez que se retire el tubo PE20 de cualquier conexión.
- Tire del émbolo de la jeringa hacia atrás 0,2 μl; creando una burbuja entre el agua estéril en el tubo / microinyector PE20 y la solución a inyectar.
- NOTA: Esta burbuja evita la dilución de la inyección, la contaminación del agua y permite monitorear el proceso de inyección, ya que se moverá durante la inyección. Se debe producir una sola burbuja sólida.
- Coloque el microinyector en el reactivo que se va a inyectar y tire lentamente del émbolo de la jeringa hasta el tope.
- Preparación de un animal para la inyección:
- Sostenga el pecho de la rata contra el pecho del experimentador. Limpie el área alrededor de las cánulas con un aplicador de algodón empapado en etanol al 70% (v / v).
- NOTA: Con un manejo adecuado, los ratones pueden sujetarse suavemente con una mano ahuecada. De lo contrario, es posible que sea necesario desaliñarse.
- Retire los obturadores con pinzas pequeñas y colóquelos en el bote de pesaje con etanol al 70% (v / v).
- Realización de inyecciones:
- Coloque el microinyector lleno en la cánula. Presione el botón de inicio en la bomba de microinyección y controle el movimiento de la burbuja.
- NOTA: Puede ser necesario aplicar una ligera presión para asegurarse de que los microinyectores no se levanten. La burbuja debe avanzar uniformemente y entrar completamente en el microinyector.
- Retire los microinyectores de la cánula y reemplace los obturadores, una vez que se complete la inyección y haya pasado el período de difusión posterior a la inyección.
- NOTA: Los tiempos típicos de difusión posterior a la inyección son de 2 a 4 minutos para los reactivos farmacológicos y de 2 a 10 minutos para los virus. Dejar el microinyector durante el período posterior a la infusión evita que el inyectado vuelva a subir por las cánulas en lugar de difundirse en el tejido. Coloque obturadores en el costado del bote de pesaje lleno de etanol para permitir que el etanol drene antes de volver a insertarlo en la cánula.