Trasplante de progenitores neuronales derivados de células madre en cortes corticales humanos

Resumen

Fuente: Palma-Tortosa, S., et.al. Cultivos organotípicos de corteza humana adulta como modelo ex vivo para el trasplante y validación de células madre humanas. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el trasplante de células progenitoras neuronales derivadas de células madre en cortes de tejido cortical humano. El procedimiento consiste en aislar y resuspender las células progenitoras en una matriz de membrana basal, seguido de su inyección en un corte cortical colocado en un conjunto de transpozo. Después de la incubación para permitir la solidificación de la matriz y la diferenciación neuronal, el tejido trasplantado se prepara para un análisis adicional.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.

1. Proliferación y diferenciación de células lt-NES

NOTA: las células madre neuroepiteliales auto-renovadoras a largo plazo derivadas de células madre pluripotentes humanas derivadas de células madre humanas (lt-NES) se generan y transducen con un vector lentiviral que transporta proteína verde fluorescente (GFP) bajo un promotor constitutivo (células GFP-lt-NES). Los viales que contienen 3 x 10 6 celdas se almacenan a -150 °C hasta su uso.

1. Preparación de las soluciones madre y media

1. Diluir 100 μg de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS)-0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) para tener una concentración de stock de 10 μg/ml. Prepare alícuotas de 100 μL.

2. Diluir 100 μg de factor de crecimiento epidérmico (EGF) en 10 mL de PBS-0,1% BSA para tener una concentración de stock de 10 μg/mL. Prepare alícuotas de 100 μL.

3. Alícuota 50x suplemento de B27 en un volumen de 100 μL por alícuota.

4. Diluya 10 mg de poli-L-ornitina en 100 ml de agua desionizada para tener una concentración de stock de 100 μg/ml. Hacer 1 mL de alícuotas.

5. Prepare 30 μL de alícuotas de 1,20 mg/mL de laminina de ratón.

6. Diluir 10 ml de tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,25%) en 90 ml de PBS hasta una concentración de stock del 0,025%. Prepare 1 mL de alícuotas.

7. Diluir 0,025 g de inhibidor de tripsina en 50 mL de PBS hasta una concentración de stock de 0,5 mg/mL. Prepare 1 mL de alícuotas.

8. Diluya 10 μg de Wnt3a (miembro 3A de la familia del sitio de integración MMTV de tipo Wingless) en 1 mL de PBS-0.1% BSA para tener una concentración de stock de 10 μg/mL. Prepare BMP4 (proteína morfogenética ósea 4) de la misma manera. Alícuota en un volumen de 100 μL.

9. Diluir 1 mg de ciclopamina en 2,5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) hasta una concentración final de 400 μg/ml y hacer alícuotas de 100 μl.

10. Prepare el medio básico (Tabla 1) y el medio definido por diferenciación (DDM, Tabla 2) y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.

2. Recubrimiento de placas de cultivo

1. Para recubrir previamente las placas para cultivar las células GFP-It-NES durante la proliferación o diferenciación, diluya la poli-L-ornitina 1:100 en agua desionizada y agregue 5 ml de la solución a un matraz T25. Incubar durante la noche a temperatura ambiente (RT).

2. Lave las placas recubiertas de poli-L-ornitina 1x con agua desionizada y 1x con PBS.

3. Para las células GFP-It-NES en proliferación, diluir la laminina de ratón a 1:500 en PBS e incubar durante al menos 2 h a 37 °C. Para las células GFP-It-NES en diferenciación, diluir la laminina de ratón a 1:100 en PBS e incubar durante al menos 2 h a 37 °C.

3. Proliferación de las células GFP-lt-NES

1. Caliente 5 ml (para lavar) y 5 ml (para sembrar) de medio básico en dos tubos diferentes de 15 ml.

2. Descongele rápidamente un vial de células GFP-lt-NES a 37 °C, transfiéralas al tubo de lavado y centrifugue a 300 x g durante 5 min.

3. Aspirar el medio con cuidado sin tocar el pellet y volver a suspender las células en 1 mL de medio básico precalentado. Transfiera la suspensión celular al tubo de siembra que contiene el medio básico suplementado con factores de proliferación: EGF (10 ng / mL), bFGF (10 ng / mL) y B27 (10 ng / mL). Siembre las células en un matraz T25 recubierto de poli-L-ornitina / laminina.

4. Alimenta las células con factores de proliferación todos los días. Reemplaza el medio si se vuelve amarillo. Pasar las células cada tercer o cuarto día (1 día después de que alcancen el 100% de confluencia).

4. División de las células GFP-lt-NES para la proliferación y diferenciación

1. Precaliente 5 ml de medio básico por matraz (para recolectar las células), más el volumen total necesario para resembrarlas.
NOTA: El paso se realiza en una dilución 1:3 para mantener las células en proliferación, lo que requiere 15 ml de medio básico y una dilución 1:6 para iniciar la diferenciación, lo que requiere 30 ml de medio básico.

2. Retire el medio del matraz de cultivo celular por aspiración y agregue 500 μL de tripsina al 0,025% precalentada. Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente. El desprendimiento de las células se puede confirmar bajo un microscopio óptico estándar con un aumento de 10x.

3. Agregue un volumen igual de inhibidor de tripsina (0,5 mg / ml de concentración final) seguido de 5 ml de medio básico tibio. Desconecte y recoja las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Transfiera las células a un tubo de 15 ml y centrifugue durante 5 min a 300 x g.

4. Para mantener las células en proliferación, vuelva a colocar en una dilución de 1:3 en medio básico fresco complementado con factores de proliferación y repita el paso 1.3.4.

5. Diferenciación cortical de las células GFP-lt-NES

1. El día 0, vuelva a suspender las células (que se utilizarán para la diferenciación) en 30 ml de medio básico suplementado con factores de proliferación y colóquelas en seis matraces T25 recubiertos de diferenciación (divididos 1:6).

2. El día 1, cambie la mitad del medio a DDM y agregue factores de proliferación a la mitad de su concentración.

3. El día 2, cambie el medio completamente a DDM suplementado con factores de diferenciación: BMP4 (10 ng/mL), Wnt3a (10 ng/mL) y ciclopamina (400 ng/mL).

4. En el día 4, agregue solo los factores de diferenciación. Reemplaza el medio si se vuelve amarillo.

5. El día 6, cambie el medio a DDM complementado con BMP4 y Wnt3a. La ciclopamina se elimina en este paso.

6. En el día 7, separe las celdas como se indica en los pasos 1.4.2 y 1.4.3.

2. Trasplante de las células GFP-lt-NES en cortes organotípicos de hACtx

NOTA: El tejido cortical humano adulto (hACtx) debe cultivarse durante 1 semana antes del trasplante celular. Para facilitar el procedimiento de trasplante, es necesario extraer 2 ml del medio hACtx de la parte superior del inserto para evitar que el tejido flote.

1. Vuelva a suspender las células GFP-lt-NES cebadas corticalmente (del paso 1.5.6) en una matriz de membrana basal pura fría (consulte la Tabla de materiales) a una concentración de 1 x 105 células / μL y transfiera la solución a un tubo estéril más pequeño.

NOTA: Durante el procedimiento de trasplante, todos los materiales (puntas de pipeta, tubos, capilares, etc.) deben enfriarse previamente para evitar la solidificación del gel. Descongele el gel de matriz de membrana basal en hielo durante 30 min antes de su uso.

2. Recoja la suspensión celular en un capilar de vidrio frío conectado a una tetina de goma para la succión. Inyecte la suspensión celular en forma de pequeñas gotas (aprox. 1 μL cada una) apuñalando la rebanada de tejido semiseco en varios sitios.

3. Incubar a 37 °C durante 30 min para que el gel se solidifique. Transfiera la placa de la incubadora a la campana y agregue con cuidado 2 ml de medio hACtx en la parte superior del inserto para sumergir completamente el tejido.

4. Reemplace el medio de cultivo con medio hACtx fresco una vez por semana.

Resultados

Tabla 1: Composición del medio de proliferación de células lt-NES (medio básico).

Basic Medium	Concentración	de stock Concentración final	Por 100 mL
DMEM/F12 con L-Glutamina	1x		98,7 mL

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MANTENIMIENTO Y CULTIVO DE TEJIDO NEOCORTICAL HUMANO Placa
de 6 pocillos	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex andamio inserto de 6 pocillos	Reinnervate Ltd	AVP004-96
Suplemento de B27 (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys sin	tecnologías de células madre	#05791	Referenciado como medio neuronal en el texto
Unidades de filtro 250 ml o 500 ml	Pinzas Corning Sigma	CLS431096/97
	Cualquier
(50 mg/ml)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenciado como L-glutamina en el texto
Tetina de goma + pipeta de vidrio	Cualquier
GENERACIÓN DE células lt-NES
2-Mercaptoetanol 50 mM	ThermoFisher Scientific
EGF recombinante libre de animales	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemento (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Albúmina bovina fracción V (solución al 7,5%)	ThermoFisher Scientific	15260037
Ciclopamina, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Solución de glucosa (45%)	Sigma	G8769
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Solución salina de tampón de fosfato de Dulbecco (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Sin calcio ni magnesio
Laminina Proteína de ratón, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Soluciones de aminoácidos no esenciales (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
Suplemento N-2 (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poli-L-Ornitina	Merk	P3655
Sistemas de investigación y desarrollo de proteínas BMP-4 humanas recombinantes		314-BP-010
Sistemas de investigación y desarrollo	de proteínas Wnt-3a humanas recombinantes	5036-WN
Piruvato de sodio (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Inhibidor de tripsina de soja, polvo	Thermo Fisher Scientific	17075029
Agua	desionizada estérilSistema	de filtrado MilliQ
MilliQ Tripsina EDTA (0,25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPO PARA CULTIVO CELULAR
Pipetas de volumen ajustable 10, 100, 200, 1000 μL	Eppendorf	Varios
Matriz de membrana basal Calificación ESC (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrífuga	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubadora	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Herramienta de corte de células madre 0,190-0,210 mm	Vitrolife	14601
Tubos estériles	Sarstedt	Varias
pipetas pasteur de vidrio desechables estériles 150 mm	VWR	612-1701
Puntas de pipeta estériles 0,1-1000 μL	Biotix VWR	Varias
pipetas serológicas estériles 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Varios
matraces T25 Nunc	ThermoFisher Scientific	156367

de rojo fenólico gentamicina adecuada 31350010