Inyección estereotáxica de virus para la modificación genética estable en un modelo de ratón

Resumen

Fuente: Porlan, E., et al. Modificación genética estable y eficiente de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de efectos autónomos y no autónomos de células madre neurales. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la modificación genética estable de células madre neurales (NSC) en la zona ventricular-subventricular (V-SVZ) mediante la inyección estereotáxica de un gen terapéutico portador de virus en un modelo de ratón. El virus ingresa a las NSC, se somete a transcripción inversa, se integra en el genoma y permite una modificación genética estable y eficiente para aplicaciones neuroterapéuticas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Inyección estereotáxica del ventrículo lateral (VI) en la zona ventricular-subventricular (V-SVZ)/borde del estriado o en el VI

1. Microinyección del VI
   1. Seleccionar y esterilizar las herramientas necesarias para la cirugía (bisturí, taladro y pinzas pequeñas).
   2. Anestesiar a un ratón de 6-8 semanas de edad inyectando por vía intraperitoneal (IP) una mezcla supervisada por veterinarios de ketamina y medoptomidina. Pesar cada animal y dosificar cada uno con 50-75 mg de ketamina y 0,5-1 mg de medetomidina por kg de peso corporal del ratón (alrededor de 100-125 μl de la solución de trabajo de ketamina/medetomidina por ratón).
   3. Evalúe el plano anestésico pellizcando los dedos de los pies, la cola o la oreja y asegurándose de que el animal no muestre ninguna reacción.
   4. Una vez anestesiado el ratón, inyectar butorfanol por vía subcutánea a una dosis final de 0,4-0,5 mg por kg de peso del ratón para minimizar el dolor postquirúrgico.
   5. Afeitar la zona entre las orejas y desinfectar la piel con un yodóforo como yodopovidona o etanol al 70%. Limpie con aplicadores estériles con punta de algodón. Tenga cuidado de no mojar excesivamente al animal, ya que esto puede exacerbar la hipotermia.
   6. Coloque al animal en posición prona sobre un marco estereotáxico y fije cuidadosamente la cabeza con las barras de los oídos y el soporte del paladar del aparato. Mantenga el mouse con una almohadilla térmica a 37 ° C y aplique lubricante oftálmico en los ojos.
   7. Haga una incisión de 1 cm de largo en la piel de la cabeza longitudinalmente con un bisturí y retraiga suavemente la piel para exponer el cráneo con pinzas finas.
   8. Limpie cuidadosamente la superficie ósea con un aplicador estéril con punta de algodón. Limpie el hueso del cráneo expuesto de cualquier tejido restante.
   9. Monte la jeringa esterilizada en el dispositivo estereotáctico usando el soporte de la jeringa.
   10. Mueva el soporte de la jeringa a lo largo de los ejes x, y y z hasta que la punta de la aguja de la jeringa se coloque en el bregma, el punto de conjunción donde la sutura sagital (longitudinal y medial) se cruza perpendicularmente con la sutura coronal (Figura 1b). Asegúrese de que la posición "cero" del eje dorso-ventral (DV) esté en la superficie del cráneo en bregma.
   11. Mueva la jeringa a las coordenadas de destino x e y (consulte la Tabla 1 y la Figura 1b).
   12. Anote las coordenadas de destino x, y y z en la escala Vernier para poder volver al sitio de inyección más adelante. Marque el hueso en las coordenadas x e y con un rotulador quirúrgico.
   13. Aleje la jeringa del área de trabajo.
   14. Con un taladro eléctrico, haga un agujero en el cráneo con cuidado para no dañar el cerebro. No taladre la superficie del pial, ya que esto puede dañar la superficie del cerebro.
   15. Cargue la jeringa con 1 μl de la solución viral 10⁶ TU/μl (unidades de transducción por microlitro). Utilice una aguja biselada afilada de calibre 33 cuya punta tenga un ángulo de 10-12°. Coloque la aguja de la jeringa en un ángulo de 90° con respecto a la superficie del cerebro.
   16. Mueva la jeringa hacia el lugar de la inyección y muévala hacia abajo hasta que la punta toque la superficie de la pial.
   17. Penetre en el cerebro con la jeringa hasta la coordenada z en el eje DV.
   18. Libere lentamente la suspensión viral a una velocidad de 0,2 μl / min para minimizar el daño al tejido cerebral debido a la presión excesiva del líquido.
   19. Espere de 5 a 10 minutos para minimizar el reflujo de la suspensión viral y luego retraiga la jeringa muy lentamente.

Region of injection	Coordinates
	Antero-posterior (AP)	Medio-lateral (ML)	Dorso-ventral (DV)
ZEE/borde estriado	+0,6 mm	+1,2	mm-3,0 mm
Ventrículo	lateral-0,3 mm	+1,0	mm-2,6 mm

Tabla 1: Coordenadas estereotáxicas para las inyecciones. Para los ejes antero-posterior (AP) y medio-lateral (ML), las coordenadas x e y se dan como una distancia (en mm) desde el bregma. "-" indica "hacia atrás". Para las coordenadas DV, "cero" es la superficie del cráneo en el punto de bregma, y las coordenadas DV indican la distancia (en mm) hacia abajo desde este punto.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática de las diferentes partes del procedimiento. (a) Generación de LVs para estudios de marcaje in vivo, desde la transfección de células 293T(HEK293T) de riñón embrionario humano con plásmidos apropiados para generar los L...

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