Manipulación de células de placa neural a través de nanoinyección en el útero en un modelo de ratón embrionario

Resumen

Fuente: Mangold, K., H el. al., Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el método de nanoinyección en el útero para la orientación de la placa neural en un modelo de ratón embrionario. Se inyecta una solución lentiviral de alto título en la cavidad amniótica, donde se integra en las células de la placa neural, lo que permite una manipulación génica estable para la investigación del neurodesarrollo y las aplicaciones terapéuticas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Inyecciones

NOTA: Todos los instrumentos utilizados en este procedimiento se esterilizan antes de la cirugía y entre cada ratón.

1. Anestesiar a la primera hembra con cavidades de tamaño ideal.
2. Coloque y fije la hembra sobre la mesa.
3. Aplique gel ocular en los ojos para prevenir la desecación de la córnea e inyecte analgésicos por vía subcutánea.
   NOTA: Analgésicos recomendados: Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg de peso corporal) o Flunixin (2,5 mg/kg) o similar de acuerdo con las normas locales de bienestar animal. La analgesia perioperatoria multimodal se mantiene con analgésicos inyectados e isoflurano.
4. Prepare asépticamente la parte inferior del abdomen limpiando con un paño empapado en solución de clorhexidina 0,5 mg / ml (o similar) y seque la piel. Use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión vertical de 1,5-2,0 cm en la línea media de la piel en la parte inferior del abdomen.
   NOTA: Prepare el área quirúrgica siguiendo las rutinas de desinfección aprobadas localmente.
5. Levante la piel suavemente y libere la piel de la capa muscular subyacente, aproximadamente 1 cm alrededor del punto de incisión, para facilitar la sutura después de la cirugía.
6. Haga una incisión vertical de 1 cm en la línea media en la capa muscular.
7. Con un par de fórceps, levante un lado de la piel y la capa muscular, y con el otro par, busque los cuernos uterinos.
   NOTA: Las deciduas están dispuestas como cuentas en un collar, mientras que el intestino es un tubo largo y continuo (Figura 1A).
8. Con fórceps, saque con cuidado ambos cuernos uterinos del abdomen. Sostenga el tejido entre embriones; no los apriete directamente (Figura 1B).
   NOTA: El útero está unido al cuerpo en el cuello uterino y los dos ovarios/oviductos están unidos a través de ligamentos. No tire ni separe el útero de estos puntos de anclaje.
9. Cuente y anote el número de embriones en los lados izquierdo y derecho.
10. Numere los embriones desde el ovario hasta el cuello uterino o desde el cuello uterino hasta el ovario.
    NOTA: Esto es especialmente importante si los embriones inyectados se recolectarán en etapas embrionarias.
11. Con un hisopo de algodón húmedo, empuje suavemente todos los embriones hacia la cavidad abdominal, excepto los tres primeros que se inyectarán.
12. Coloque una gota de PBS (solución salina tamponada con fosfato) sobre el elástico en la placa de Petri y sosténgalo inmediatamente encima de los embriones.
13. Inserte fórceps cerrados en la incisión del elástico y suelte los fórceps para abrir la incisión elástica para que el líquido caiga sobre los embriones.
    NOTA: Esto asegura la rehidratación de los embriones y que la membrana elástica se adhiera a la piel húmeda de la hembra, evitando la fuga de PBS en los siguientes pasos.
14. Tire de una sección del útero, correspondiente a tres embriones, a través del elástico con fórceps y coloque suavemente la placa de Petri en el abdomen de la hembra.
15. Con las pinzas y un hisopo de algodón húmedo, ajuste la posición del útero y el elástico para asegurarse de que el elástico esté sellado a la piel de la mujer para evitar fugas de PBS.
16. Use los cuatro pies de arcilla para asegurar y sujetar la placa de Petri inmediatamente por encima del abdomen, reduciendo la presión sobre la hembra y la sensibilidad de las imágenes a la respiración y los latidos del corazón de la hembra.
17. Presione el cilindro de arcilla de modelar hacia abajo a la derecha de los embriones / útero para fijar el útero (Figura 1C).
    NOTA: Esta instrucción de orientación asume que la aguja está a la izquierda de la hembra y que los embriones del cuerno uterino izquierdo de la hembra están expuestos. El lado del útero (cuerno uterino izquierdo o derecho) es crucial ya que el amniótico (AC) se enfrenta a la aguja (cuerno izquierdo; Figura 1D) o se enfrenta al cilindro de arcilla estabilizadora (cuerno derecho; Figura 1E).
18. Para inyectar embriones por el cuerno uterino derecho, coloque el cilindro de arcilla en el lado izquierdo de los embriones (Figura 1F) y gire la mesa de calentamiento 180° (Figura 1G) para lograr la orientación correcta. Si la aguja se puede mover en su lugar, adáptela según corresponda a la configuración correspondiente.
19. Agregue PBS a la placa de Petri hasta que los embriones y el útero estén cubiertos con PBS.
20. Baje la sonda de ultrasonido en el PBS y ajuste la mesa de ratón/quirúrgica para que el primer embrión esté alineado con la sonda de ultrasonido para facilitar el registro de las inyecciones.
    NOTA: "Primero" se refiere a la numeración de embriones desde el ovario hasta el cuello uterino.
21. Escanee los tres embriones e inspeccione los AC. Determine el volumen de inyección de la siguiente manera:
    1. Mida el diámetro del aire acondicionado con la máquina de ultrasonido. Inyecte 69 nL si el diámetro de CA es de ≤0,2 mm; inyectar 2 x 69 nL (= 138 nL) si el diámetro de CA es de >0,2 mm y ≤0,29 mm; e inyectar 3 x 69 nL (= 207 nL) si el diámetro de CA > 0,29 mm (Figura 1H).
       >NOTA: Experimentos anteriores han demostrado que los volúmenes de inyección de hasta 207 nL son bien tolerados en E7.5. Las inyecciones exitosas con un impacto mínimo en la supervivencia se logran cuando el aumento de volumen relativo de la CA no supera el 90%. La variación en el tamaño de AC entre compañeros de camada o cepas de ratones es común y puede requerir una mayor optimización.
22. Ajuste los volúmenes de inyección con el controlador de inyección.
23. Ajuste la velocidad de inyección a lenta con una velocidad de inyección de 23 nL/s.
    NOTA: Diferentes modelos de equipos pueden resultar en diferentes fuerzas de inyección.
24. Baje la aguja en el PBS usando las ruedas principales del sistema de rieles (planos x y z, Figura 1I) y presione Vaciar en el controlador del nanoinyector hasta que el líquido llegue a la punta de la aguja.
    NOTA: Si la aguja se ha obstruido, presionar Vaciar puede disolver la obstrucción y/o expulsar la obstrucción.
25. Levante la aguja del PBS y presione Inyectar. Verifique que se descargue una gota del volumen deseado aproximado.
26. Baje la aguja en el PBS y alinéela con la sonda de ultrasonido y el embrión moviendo el nanoinyector con la rueda del plano Y en el micromanipulador (Figura 1J).
    NOTA: La punta de la aguja está perfectamente alineada cuando aparece como un punto brillante en la imagen de ultrasonido (Figura 1K, L). La aguja se puede mover en los tres planos de dirección con el micromanipulador.
27. Ajuste el ángulo de la aguja con la rueda de ángulo de inyección para garantizar un ángulo de inyección casi perpendicular en relación con la pared uterina. Inserte la aguja en el aire acondicionado con un solo movimiento usando la rueda de inyección en el micromanipulador (Figura 1J-M). Vigile el brillo de la punta de la aguja. Si la punta de la aguja desaparece de la imagen de ultrasonido, mueva la sonda de ultrasonido hacia adelante o hacia atrás para volver a enfocar la aguja.
    NOTA: Una vez que la aguja está dentro del aire acondicionado, se pueden realizar modificaciones menores en la posición y el enfoque de la aguja sin dañar al embrión (ajustes dentro de ~0,3 mm). No ajuste la posición de la aguja más que esto.
28. Presione Inyectar (para 207 nL, ajuste el volumen a 69 nL e inyecte tres veces). Después de la inyección, espere de 5 a 10 segundos adicionales antes de retraer la aguja con un movimiento suave.
29. Mueva la etapa al siguiente embrión y repita los pasos 1.22-1.26 para los otros dos embriones si tienen tamaños AC adecuados.
30. Levante la sonda de ultrasonido y la aguja del PBS con el micromanipulador. Aleje la aguja del operador para evitar daños y lesiones.
31. Con fórceps, dirija el 1er y 2do embriones hacia el abdomen de la hembra empujándolos suavemente a través del elástico. Agarre suavemente el tejido adyacente al tercer embrión y tire del útero hacia el extremo superior de la incisión elástica. Levante suavemente los embriones 4º-6º con fórceps y permita que el 3er embrión vuelva a entrar en el abdomen.
    NOTA: Este paso se puede realizar sin cambiar el PBS o quitar la placa de Petri.
32. Repita según sea necesario hasta que se hayan inyectado todos los embriones con CA óptimos o se haya alcanzado el límite de tiempo.
33. Empuje suavemente los embriones / útero hacia el abdomen de la hembra.
34. Aspira el PBS y retira la placa de Petri. Si se ha utilizado un virus, manéjelo como un residuo infeccioso.
35. Coser la capa muscular con Vicryl (USP 6-0, longitud de la aguja 13 mm, 3/8 Círculo) en suturas simples continuas o interrumpidas y cerrar la piel con 1-2 clips (ver la Tabla de Materiales).
36. Apague la bomba de isoflurano.
37. Retire la cinta quirúrgica y coloque a la hembra en posición prona (boca abajo) en una jaula limpia sobre una placa calefactora a 40 °C.
    NOTA: Se espera que la hembra recupere la conciencia y se mueva en 10 minutos. Asegúrese de que el procedimiento se complete en 30 minutos. Los antecedentes genéticos, la edad y el peso de la hembra pueden influir en la sensibilidad a la anestesia. Monitoree a los ratones durante la cirugía para detectar signos de respiración lenta (la respiración lenta significa que la anestesia es demasiado profunda) o movimiento (la anestesia es demasiado ligera). La buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg de peso corporal) o la flunixina (2,5 mg/kg) o similar, de acuerdo con las normas locales de bienestar animal, pueden administrarse 8 horas después de la primera inyección si es necesario.
38. Si se va a inyectar otra hembra, prepare el área quirúrgica mientras monitorea el despertar de la primera.
    1. Limpie las herramientas quirúrgicas con etanol al 70% para eliminar cualquier residuo de sangre o tejido y esterilícelas en el esterilizador de perlas de vidrio precalentado durante 10 s. Deseche los hisopos de algodón y use papel de seda. Seque la placa de Petri y los trozos de arcilla con papel de seda.
39. Repita los pasos 1.1-1.35 hasta que todas las hembras hayan sido inyectadas.
40. Vacíe y deseche la aguja.
    1. Si queda un virus o una solución inyectable en la aguja, presione Vaciar en el nanoinyector y vacíe el contenido de la aguja en papel de seda.
    2. Retraiga el émbolo metálico por completo pulsando Rellenar hasta que se produzca un doble pitido del mando, lo que indica que el émbolo está completamente retraído.
    3. Afloje la pinza y deslice la aguja fuera del émbolo de metal. Deseche la aguja en el contenedor de desechos punzantes.
41. Limpie el banco BSL-2 (Nivel 2 de bioseguridad).
    1. Si se usara un virus, rocíe todo el campo quirúrgico con desinfectante (consulte la Tabla de materiales). Después de 15 minutos, limpie el desinfectante y limpie todo el campo quirúrgico con etanol al 70%. Si no se usó ningún virus, limpie todas las superficies con etanol al 70%.
    2. Limpie cualquier PBS restante de la sonda de ultrasonido con papel de seda seco, suave y sin pelusa.
42. Deseche los desechos de acuerdo con las pautas de bioseguridad.
43. Apague la máquina de ultrasonido, la mesa calefactora, el banco BSL2 y el suministro de O₂.

Resultados

Figura 1: Tamaño y orientación óptimos de la cavidad amniótica para inyecciones exitosas.) Cuerno uterino con múltiples E7.5 deciduas, en forma de una cadena de esferas (abajo) en comparación con el intestino grueso (arriba). ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL Jeringa	BD Bioscience	309628
Aguja de 27 G	BD Bioscience	300635
3.5 pulgadas capilares	Drummond Scientific	3000203G/X	Se utilizaron para extraer agujas de la casa
Transductor de la serie MS de 70 MHz	Visual Sonics	MS700
Aquasonic gel de ultrasonido transparente	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 ratones	Charles River, Alemania	Crl: CD1 (ICR)	Hembras: a partir de las 8 semanas de edadMachos: a partir de las 12 semanas de edad
Hisopo de algodón	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Pinzas de apósito delicadas rectas 13 cm	Agnthos	08-032-130
EZ clips 9 mm	Angthos	59027	Clips
Tijeras Iris, Super Cut, rectas, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Isofluorano	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Comprado en una farmacia sueca
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Cinta de membrana	Visual Sonics	SA-11053
Extractor de micropipetas	Instrumento Sutter	P-97
Plastilina de modelado Sense	AB	10209
Mesa de manejo del ratón	Visual Sonics	50249
Kit de autoinyectores Nanoject II	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
placa de Petri con apertura central (pared baja)	Sonics	SA-11620
(ØxAl): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	Desinfectante 130000132037
Membrana de silicona	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, esterilizador de perlas calientes	Angthos	31100
Cinta quirúrgica (1,25 cm x 9,14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Sistema de anestesia	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Estación de imágenes 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; Aguja C-3, filamento púrpura de 45 cm	Agnthos	J384H

Placa de Petri Visual ,