Transferencia de genes a las células de Schwann del nervio ciático de roedores mediante electroporación

Resumen

Fuente: Ino, D. et. al., Transferencia de genes in vivo a células de Schwann en el nervio ciático de roedores por electroporación. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la transferencia de genes in vivo a las células de Schwann del nervio ciático de roedores mediante electroporación. Se inyecta una solución de colorante de ADN plasmídico en el nervio y los pulsos eléctricos facilitan la entrada de ADN. Posteriormente, el ADN se integra en el genoma de la célula, lo que permite una transferencia exitosa de genes en las células de Schwann.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de ADN plasmídico

1. Genere plásmidos de ADN para electroporación in vivo mediante la subclonación del ADN complementario (ADNc) o la secuencia de ARN de horquilla corta (ARNhc) en un plásmido de expresión para células de mamíferos. Utilice un potenciador temprano inmediato de citomegalovirus y un plásmido impulsado por el promotor de la fusión del promotor de la β-actina (CAG) del pollo porque permite una expresión fuerte y estable. Para la expresión de ARNhc bajo el control de un promotor CAG, utilice un sistema de casete de ARNhc basado en mir30 para subclonar el ARNhc.
2. Purifique el ADN plasmídico con un kit de preparación maxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante y vuelva a suspender el ADN con solución salina tamponada con HEPES (cloruro de sodio 140 mM, NaCl, hidrogenofosfato disódico 0,75 mM, Na₂HPO₄, ácido 25 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES); pH 7,40). Ajuste la concentración de ADN a ≥4 μg/μl.
3. Prepare la solución de ADN plasmídico a una concentración de 4 μg/μl y agregue una cantidad mínima de colorante verde rápido (concentración final de 0,01%) para etiquetar el lugar de la inyección. Cuando se requiera la electroporación simultánea de múltiples plásmidos, ajuste la concentración total de la solución de ADN plasmídico a 4 μg/μl.
   NOTA: La composición óptima de los ADN plasmídicos debe determinarse de acuerdo con la eficiencia de transfección de cada plásmido.

2. Esterilización de instrumentos quirúrgicos e instrumentos quirúrgicos de autoclave de solución salina

1. y la solución de NaCl al 0,9%.

3. Preparación de la micropipeta de vidrio

1. Tire de las pipetas de vidrio con un extractor de pipetas. Corte la punta de la pipeta a un diámetro de 30-50 μm. Utilice los siguientes parámetros: Calor, 600; Velocidad, 50; Tiempo, 75.

4. Cirugía animal, inyección de ADN y electroporación

NOTA: En la Figura 1 se describe una descripción general de este paso. Aunque el procedimiento para las crías de rata se describe aquí, el método también es aplicable a animales más maduros que utilizan el mismo procedimiento.

1. Anestesiar a la rata con isoflurano en la caja de inducción hasta que el animal quede inmóvil ajustando el flujo de oxígeno a 0,4 L/min y la concentración de isoflurano al 4% (vol/vol). Realice pellizcos en los dedos de los pies para confirmar la anestesia adecuada.
2. Coloque a la rata en el calentador precalentado bajo un microscopio binocular y mantenga la anestesia administrando continuamente isoflurano a través de la mascarilla. Ajuste el flujo de oxígeno a 0,2 L/min y la concentración de isoflurano al 2% (vol/vol). Use gotas para los ojos para prevenir la sequedad de los ojos si los ojos del animal están abiertos.
3. Fije las piernas con cinta quirúrgica.
4. Limpie la piel de la parte posterior del muslo con povidona yodada y haga una incisión con un bisturí
   NOTA: Afeite las áreas quirúrgicas si están cubiertas de vello.
5. Exponga el nervio ciático creando una abertura entre el músculo cuádriceps femoral y el músculo bíceps femoral con agujas de coser.
6. Humedezca el nervio con una solución de NaCl al 0,9%. Absorbe el exceso de agua con papel sin pelusa.
7. Inserte la base de una micropipeta de vidrio en un tubo flexible y llene la cantidad adecuada de solución de ADN (al menos un microlitro) en la micropipeta aspirando suavemente.
8. Levante el nervio expuesto tirando suavemente del lado distal del nervio con una aguja.
   NOTA: No aplique tensión al nervio para minimizar el estrés mecánico.
9. Inserte la micropipeta de vidrio en el sitio distal del nervio e inyecte la solución de ADN aplicando presión (es decir, soplando en el extremo abierto del tubo flexible). Inyecte la solución de ADN hasta que el nervio aparezca verde (1 μl como máximo). Debido a que la inserción frecuente de la micropipeta puede dañar el nervio, no inserte la micropipeta más de dos veces.
10. Coloque un electrodo de platino tipo pinza a unos 1-2 mm de distancia del nervio. Llene el espacio entre el electrodo y el nervio con una solución de NaCl al 0,9%.
    NOTA: No sujete el nervio con el electrodo para evitar la tensión mecánica en el nervio.
11. Aplique pulsos eléctricos en el lugar de la inyección usando un electroporador con el electrodo. Después del primer ajuste de pulsos, invierta el electrodo y aplique otro conjunto de pulsos. Utilice los siguientes parámetros: voltaje, 50 V; duración del pulso, 5 mseg; intervalo de pulso, 100 mseg; número de pulso, 4 veces.
12. Limpie el sitio de electroporación con una solución de NaCl al 0,9

%.

5. Post-electroporación

1. Cerrar las incisiones con pegamento de cianoacrilato.
2. Después de secar el pegamento, limpie la herida con povidona yodada.
3. Libere al cachorro de la mascarilla. Caliente al cachorro en un calentador durante al menos una hora para permitir que se recupere completamente de la anestesia.

Resultados

Figura 1: Esquema del método de electroporación in vivo. Primero, se expone el nervio ciático de la rata anestesiada. En segundo lugar, se inyecta ADN plasmídico en el nervio ciático. En tercer lugar, los pulsos eléctricos se envían al lugar de la inyecci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Genopure plásmido Maxi kit	Roche	03 143 422 001	Kit de purificación de ADN plasmídico
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Colorante para inyección
de ADN GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Vidrio
capilar Tubo de succión	Drummond	05-2000-00	Tubo de succión para microinyección
MODELO P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.		de micropipetas
CUY21	BEX	celda CUY21 Generador	de pulsos
Calentador eléctrico	KODEN	CAH-6A	Calentador durante la cirugía
Isofluolano	Mylan	1119701G1076	Anestésico

Extractor Electroporador de una sola de celda única