Administración sostenida del factor de crecimiento nervioso mediante una película de silicio poroso en células de feocromocitoma de rata 12

Resumen

Fuente: Rosenberg, M., et al. Diseño de películas de silicio porosas como portadoras del factor de crecimiento nervioso. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra el uso de una película de silicio poroso nanoestructurado (PSi) degradable para la liberación sostenida del factor de crecimiento nervioso (NGF) para apoyar la diferenciación celular PC12. El NGF se adsorbe en los poros de la película a través de interacciones electrostáticas y se libera gradualmente en los medios por difusión y degradación del andamio. Esta administración controlada promueve la supervivencia de las células PC12 y facilita el crecimiento y la ramificación de neuritas durante un período prolongado.

Protocolo

1. Fabricación de portadores de silicio poroso oxidado (PSiO₂)

1. Corte una oblea de silicio (Si) (un solo lado pulido en la cara de <100> y fuertemente dopado con boro, tipo p, 0,95 mΩ·cm) en muestras de 1,5 cm × 1,5 cm con un bolígrafo con punta de diamante.
2. Oxidar las muestras de Si en un horno tubular a 400 °C durante 2 h en aire ambiente (velocidad de calentamiento: 25 °C/min, enfriamiento natural).
3. Sumerja las muestras de Si en una solución de ácido fluorhídrico (HF) acuoso (48%), agua doblemente destilada (ddH₂O) y etanol (99,9%) (1:1:3 v/v/v) durante 5 min; luego enjuague las muestras con etanol tres veces y séquelas bajo una corriente de nitrógeno.
   NOTA: Prepare y almacene la solución de HF solo en artículos de plástico, ya que HF disuelve el vidrio.
   PRECAUCIÓN: HF es un líquido altamente corrosivo y debe manipularse con sumo cuidado. En caso de exposición, enjuague bien con agua y trate el área afectada con gel antídoto HF; busque atención médica de inmediato.
4. Monte la muestra de Si en una celda de grabado de politetrafluoroetileno, utilizando una tira de papel de aluminio como contacto posterior y una bobina de platino como contraelectrodo.
5. Grabe una capa de sacrificio en una solución 3:1 (v/v) de HF acuoso y etanol (99,9%) durante 30 s a una densidad de corriente constante de 250 mA/cm²; luego enjuague la superficie de la película PSi resultante con etanol tres veces y séquela bajo una corriente de nitrógeno.
6. Disuelva la capa porosa recién grabada en una solución acuosa de hidróxido de sodio (NaOH) (0,1 M) durante 2 min. Luego, enjuague con etanol tres veces y seque bajo una corriente de nitrógeno.
7. Sumerja la muestra en una solución acuosa de HF (48%), ddH₂O y etanol (99,9%) (1:1:3 v/v) durante 2 min. Luego, enjuague con etanol tres veces y seque bajo una corriente de nitrógeno.
8. Grabe electroquímicamente la muestra de Si en una solución 3:1 (v/v) de HF acuoso y etanol (99,9%) durante 20 s a una densidad de corriente constante de 250 mA/cm²; luego enjuague la superficie de la película PSi resultante con etanol tres veces y séquela bajo una corriente de nitrógeno.
9. Oxidar térmicamente las muestras de PSi recién grabadas en un horno tubular a 800 °C durante 1 h en aire ambiente (velocidad de calentamiento: 25 °C/min, enfriamiento natural) para formar un andamio poroso de SiO₂ (PSiO₂).
10. Aplique una capa giratoria a las muestras de PSiO₂ con un fotorresistente grueso positivo a 4.000 rpm durante 1 min; luego hornee las muestras recubiertas a 90 °C durante 2 min (velocidad de calentamiento: 5 °C/min, enfriamiento natural).
11. Corte las muestras de PSiO₂ en muestras de 8 mm × 8 mm con una sierra para cortar en cubitos.
12. Para eliminar la fotorresistencia, remoje las muestras cortadas en cubitos en acetona durante 3 h; luego enjuague bien con etanol y seque bajo una corriente de nitrógeno.

2. Carga de PSiO₂ con factor de crecimiento nervioso (NGF)

1. Para preparar la solución de carga de NGF, disuelva 20 μg de β-NGF murino en 400 μL de solución salina tamponada con fosfato 0,01 (v/v) de solución salina tamponada con fosfato 0,01 M (PBS) y ddH₂O.
2. Agregue 52 μl de la solución de carga sobre la muestra de PSiO₂ e incube durante 2 h a temperatura ambiente (RT) en un plato tapado.
   NOTA: Mantenga una humedad alta en el plato para evitar que la solución se seque durante la incubación.
3. Recoja la solución encima de la muestra para la posterior cuantificación del contenido de NGF dentro del portador PSiO₂.
   NOTA: La carga de NGF en PSiO₂ debe realizarse inmediatamente antes del uso previsto; el protocolo no se puede pausar aquí debido al riesgo de secado y desnaturalización de la proteína.

3. Viabilidad celular y crecimiento en presencia de cultivo celular de feocromocitoma de rata portador de PSiO₂ cargado con NGF

1. (PC12)
   1. Prepare el medio de crecimiento básico agregando un 10% de suero de caballo (HS), un 5% de suero bovino fetal (FBS), un 1% de L-glutamina, un 1% de penicilina-estreptomicina y un 0,2% de anfotericina al medio del Instituto Médico Roselle Park (RPMI).
   2. Prepare un medio de diferenciación agregando 1% de HS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,2% de anfotericina al medio RPMI.
   3. Cultivar suspensión celular (10⁶ células) en un matraz de cultivo^{de 75 cm 2} con 10 mL de medio de crecimiento básico durante 8 días; cada 2 días, añadir 10 mL de medio de crecimiento básico al matraz.
   4. Para generar un cultivo celular diferenciado de PC12, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga; centrifugue las células durante 8 min a 200 x g y RT. Deseche el sobrenadante.
   5. Suspender las células en 5 ml de medio de crecimiento básico fresco y volver a centrifugar las células durante 5 min a 200 x g y RT; desechar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 3 ml de medio de crecimiento básico.
   6. Para separar los grupos de células, aspire las células diez veces con una jeringa de 23 G.
   7. Cuente las células usando un contador de células hemocitómetro y siembre 10⁴ células/cm² área de trabajo en placas recubiertas de colágeno tipo I en presencia de medio de diferenciación.
   8. Después de 24 h, agregue β-NGF murino fresco (50 ng/mL) o portador PSiO₂ cargado con NGF por placa.
      >NOTA: Las concentraciones más altas de NGF (>50 ng/mL) poseen el efecto exacto que la concentración especificada.
   9. Renueve el medio de diferenciación cada 2 días.
   10. Para evaluar la viabilidad celular, añadir el 10% (v/v) de la solución indicadora de viabilidad (a base de resazurina) en puntos temporales representativos e incubar durante 5 h a 37 °C; medir la absorbancia a 490 nm utilizando un espectrofotómetro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetone	Gadot	830101375
Amphotericin	Biological Industries	03-028-1B
HF acuoso (48%)	Merck	101513
AZ4533 fotorresistente	Química de metales, Inc.	AZ4533
BSA fracción v	MP biomédica	216006950
solución BSA (10%)	Biological Industries	03-010-1B
Colágeno tipo l	Corning Inc.
Colagenasa	Enco	LS004176
Cubreobjetos de plástico recubiertos de colágeno	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-glucosa	Sigma-Aldrich Chemicals	G8170
Dispasa-II	Sigma-Aldrich Chemicals	4942078001
Absoluto de etanol (99,9%)	Merck	818760
FBS	Biological Industries	04-121-1A
Guanidina-HCl	Sigma-Aldrich Chemicals	G7294
Mezcla de nutrientes F-12 de Ham	Thermo Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	Biological Industries	04-124-1A
L-15 medium	Sigma-Aldrich Chemicals	L5520
Laminin	Thermo Scientific	23017015
L-glutamina	Biological Industries	03-020-1A
Murine β-NGF	Peprotech	450-34-20
Burro normal suero (NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
Papaína	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS (pH 7,4)			Preparado disolviendo 10 mM de Na₂HPO₄, 1,8 mM de KH₂PO₄, 137 mM de NaCl y 2,7 mM de KCl en agua doblemente destilada (ddH₂O, 18 MΩ·cm).
PBS X10	Biological Industries	02-020-1A
Línea celular PC12	ATCC	CRL-1721
Penicilina-estreptomicina	Biological Industries	03-032-1B
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich Chemicals	P4832
Reactivo PrestoBlue	Thermo Scientific	A13261
RPMI medio	Biological Industries	01-100-1A Oblea
de Si	Siltronix Corp.		Altamente dopado con B, tipo p, resistividad de 0,00095 Ω cm, <100> orientado
Azida de sodio	Sigma-Aldrich Chemicals	S2002
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
Ácido tánico	Sigma-Aldrich Chemicals	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	AÑO 1279

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