Expresión génica mediante electroporación unicelular en cultivos de cortes de hipocampo de ratón

Resumen

Fuente: Keener, D. G., et al. Electroporación unicelular a través de diferentes cultivos de cortes organotípicos de neuronas inhibidoras excitadoras y específicas de clase del hipocampo de ratón. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra el proceso de electroporación unicelular para introducir ADN plasmídico en las neuronas dentro de cultivos de cortes de hipocampo de ratón. El procedimiento implica un posicionamiento preciso de la pipeta, ajustes de presión y pulsos de electroporación para permeabilizar transitoriamente la membrana neuronal, lo que facilita la transferencia de genes. Después de la electroporación, el corte se incuba para permitir la expresión del gen de interés introducido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal correspondiente.

1. Preparación del cultivo

1. de rodajas Prepare cultivos de rodajas organotípicas del hipocampo de ratón como se describió anteriormente, utilizando ratones postnatales de 6 a 7 días de edad de cualquier sexo.
   1. Preparar medios de disección para el cultivo organotípico de rodajas que consisten en (en mM): 238 sacarosa, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ y 11 glucosa en agua desionizada, luego gas con 5% CO₂/95% O₂ a un pH de 7,4.
   2. Prepare medios de cultivo organotípicos en rodajas que consistan en: 78,8% (v/v) de medio esencial mínimo Eagle, 20% (v/v) de suero de caballo, 17,9 mM de NaHCO₃, 26,6 mM de glucosa, 2 M de CaCl₂, 2 M de MgSO₄, 30 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES), insulina (1 μg/ml) y 0,06 mM de ácido ascórbico, pH ajustado a 7,3. Ajuste la osmolaridad a 310-330 osmol usando un osmómetro.
   3. Diseccionar el hipocampo de todo el cerebro usando dos espátulas y cortar (400 μm) con un cortador de tejidos. Separe las rodajas utilizando dos pinzas y transfiéralas a insertos de cultivo celular de 30 mm en una placa de 6 pocillos llena de medios de cultivo (950 μL) debajo de los insertos.
2. Almacene los cultivos organotípicos en rodajas en una incubadora de cultivos de tejidos (35 °C, 5 % de CO₂) y cambie los medios de cultivo en rodajas cada dos días.

2. Preparación del plásmido

1. Prepare el plásmido para el gen de interés.
   1. Subclonar el gen de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en un vector pCAG.
   2. Purifique el plásmido pCAG-EGFP con un kit de purificación libre de endotoxinas y disuelva en una solución interna que consiste en agua tratada con pirocarbonato de dietilo que contiene 140 mM de K-metanosulfonato, 0,2 mM de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), 2 mM de MgCl₂ y 10 mM de HEPES, ajustado a pH 7,3 con KOH (concentración de plásmido: 0,1 μg/μL).

3. Preparación de la pipeta de vidrio

1. Tire de las pipetas de vidrio de borosilicato (4,5 – 8 MΩ) en un extractor de micropipetas (Figura 1A).
   NOTA: Las pipetas de vidrio utilizadas para los registros de pinzas de parche de células enteras son ideales para la electroporación.
2. Hornee pipetas de vidrio durante la noche a 200 ° C para esterilizar.
3. Compruebe el tamaño de la punta de la pipeta bajo un microscopio de disección para aproximar la resistencia eléctrica.
   1. Opcional:Verifique la resistencia de la pipeta conectando la pipeta al electrodo de electroporación y utilice el micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) esterilizado por filtro que contiene (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ y 11 glucosa en agua desionizada, gaseada con 5% de CO₂/95% O₂ a un pH de 7,4. Confirme la resistencia real utilizando la lectura en el electroporador.
      NOTA: Cuanto más afilada sea la punta de la pipeta, mayor será la resistencia eléctrica. La resistencia de la pipeta debe ser inferior a 10 MΩ. Las pipetas de vidrio con alta resistencia a las pipetas (Figura 1B) a menudo se obstruyen en la punta durante la electroporación repetida.

4. Configuración del equipo de electroporación

1. Instale el electroporador en un equipo de electrofisiología estándar de celda completa, equipado con un microscopio vertical montado en una mesa de desplazamiento, un micromanipulador y una bomba peristáltica.
2. Instale la platina principal del electroporador en un micromanipulador y conecte un par de altavoces al electroporador. Conecte el electroporador a un pedal que se puede usar para enviar un pulso cuando esté listo.
   NOTA: Los altavoces emiten un tono cuando se encienden, que es un indicador de la resistencia eléctrica en el electrodo. Esto permite determinar los cambios relativos en la resistencia sin desviar la atención del procedimiento.

5. Preparación de electroporación

1. Transfiera los insertos de cultivo en rodajas de placas de 6 pocillos a placas de Petri de 3 cm cargadas con 900 μl de medios de cultivo y almacenadas en una incubadora de CO₂ de sobremesa hasta que estén listas para realizar la electroporación.
   1. Preincube los insertos de cultivo frescos con medios de cultivo en rodajas (1 ml) durante al menos 30 min en una placa de Petri de 3,5 cm para cultivar rodajas después de la electroporación.
2. Limpie y prepare la plataforma para la electroporación.
   1. Perfunda las líneas con lejía al 10% durante 5 minutos para esterilizar el tubo y la cámara antes de comenzar el experimento del día.
   2. Perfunda las líneas con agua desionizada esterilizada en autoclave durante al menos 30 min para enjuagar completamente.
   3. Perfunda las líneas con aCSF esterilizado por filtro que contiene 0,001 mM de tetrodotoxina (TTX).
      NOTA: TTX minimiza la toxicidad celular y la muerte debido a la sobreexcitación de las interneuronas.
3. Establezca los parámetros de pulso del electroporador: amplitud de 5 V, pulso cuadrado, tren de 500 ms, frecuencia de 50 Hz y ancho de pulso de 500 μs.
4. Llene la pipeta de vidrio con 5 μl de solución interna que contenga plásmido.
   1. Elimine las burbujas de aire atrapadas en la punta de la pipeta moviendo y golpeando suavemente la punta varias veces.
   2. Compruebe si la punta está dañada visualizándola bajo un microscopio de disección o repitiendo el paso 3.3.1 para comprobar la resistencia de la pipeta.
      NOTA: Si la punta está dañada, la pipeta de vidrio debe desecharse, y este paso debe repetirse con una nueva pipeta de vidrio previamente preparada en el Paso 3.
5. Fije firmemente la punta de la pipeta al electrodo y encienda los altavoces. Registre la lectura (la resistencia de la pipeta) del electroporador cuando la punta haya entrado en contacto con el medio aCSF.
6. Corte la membrana del inserto de cultivo con una cuchilla afilada y aísle una rebanada de cultivo. Transfiera cuidadosamente el cultivo de rodajas a la cámara de electroporación con pinzas de ángulo agudo y fije su posición con un anclaje de corte.
   1. No mantenga el cultivo de rodajas fuera de la incubadora durante más de 30 minutos a la vez para evitar efectos secundarios como cambios en la salud o función neuronal.

6. Electroporar las células de interés

1. Aplique presión positiva a la pipeta con la boca o utilizando una jeringa de 1 ml (presión de 0,2 a 0,5 ml) conectada al tubo.
2. Utilice los controles de perilla tridimensionales del micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta cerca de la superficie del cultivo de corte.
3. Elija una célula diana y acérquese a ella, manteniendo la presión positiva aplicada hasta que se forme un hoyuelo en la superficie celular que sea visible bajo un microscopio.
4. Realizar ciclos de presión.
   1. Aplique rápidamente una presión negativa suave por la boca para que se forme un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana plasmática, lo que se indica visualmente por la membrana que sube un poco hacia la punta de la pipeta. Observe un aumento (~2,5 veces la resistencia inicial) en la resistencia de la pipeta escuchando un aumento en el tono proveniente de los altavoces. Vuelva a aplicar rápidamente la presión positiva para que el hoyuelo se vuelva a formar.
   2. Complete inmediatamente al menos dos ciclos de presión más sin hacer una pausa, luego mantenga la presión negativa durante 1 s.
      NOTA: Hacer una pausa entre ciclos, aplicar demasiada presión o mantener la presión negativa durante demasiado tiempo puede causar un daño significativo a la celda y posiblemente hacer que la celda muera durante la electroporación.
5. Pulse rápidamente el electroporador una vez que use el pedal cuando el tono de los altavoces alcance un vértice estable en tono, lo que indica una resistencia eléctrica máxima. No espere en la resistencia máxima durante más de 1 s antes de enviar el pulso.
   NOTA: No hemos observado ninguna electroporación fuera del objetivo al usar este protocolo. Solo se transfectaron las células en contacto con la pipeta de vidrio durante los ciclos de presión. Colocar la pipeta cerca de otras neuronas no da lugar a la transfección de genes.
6. Retraiga suavemente la pipeta aproximadamente 100 μm de la celda sin aplicar presión.
7. Vuelva a aplicar presión positiva, verificando que la resistencia sea similar a la lectura registrada en el paso 5.5, luego acérquese a la siguiente celda.
   >
   1. Elimine las posibles obstrucciones, indicadas visualmente o por una resistencia de la pipeta significativamente mayor (>15% mayor) después de la electroporación, aplicando presión positiva.
      >NOTA: Si no hay ninguna obstrucción visible y la resistencia sigue siendo significativamente mayor, deseche la pipeta y utilice una nueva. En promedio, una pipeta se puede usar para hasta 20 eventos de electroporación si el usuario tiene cuidado.
8. Después de la electroporación, transfiera el cultivo en rodajas a un inserto de cultivo fresco e incube a 35 ° C en la incubadora durante un máximo de 3 días.

Resultados

Figura 1: Dos imágenes representativas de pipetas de vidrio. (A) Mostrar pipetas de menor resistencia (6,5 MΩ), utilizadas en este protocolo, y (B) pipetas de mayor resistencia (10,4 MΩ) típicas de los protoco...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Preparación
Kit de purificación de plásmidos	Qiagen	12362
Preparación organotípica para cultivo en rodajas
	Cortadora de tejidos Binder	BD C150-UL
McIlwain	TED PELLA, INC.	10180	Picador de tejidos para la preparación de cultivos organotípicos en rodajas
Inserto de cultivo celular Millicell, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Insertos organotípicos para cultivo en rodajas
Osmómetro	Precision Systems	Osmette II
	Cole-Parmer	SK-06369-11
Tijeras	FST	14958-09
Microscopio estereoscópico	Olympus	SZ61
Sistema de filtración al vacío estéril	Millipore	SCGPT01RE	Filtración y almacenamiento de aCSF
			electrodos
Vidrios capilares	Warner Instruments	640796
Extractor de micropipetas	Instrumento de sutter	P-1000	Extractor
aglutinante	de horno	BD (E2)
Extractor de filamento	Instrumento de sutter	FB330B	Extractor
Electroporación
3,5 mm Falcon Petri Platos	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
Sistema de electroporación	Dispositivos moleculares	Axoporación 800A	Electroporador

de plásmidos Placas de 6 pocillos GREINER BIO-ONE 657160 Dumont #5/45 Pinzas FST#5/45 Pinzas de disección en ángulo para la preparación organotípica de cultivos en rodajas Matraz Unidad de filtro Millipore SCHVU02RE Filtración y almacenamiento de medios de cultivo Incubadora Espátulas recubiertas de PTFE Preparación de de unicelular