Inyección de péptidos autoensamblables y células precursoras neurales para la reparación de la médula espinal en un modelo de rata

Resumen

Fuente: Zweckberger, K., et al. Uso sinérgico de células precursoras neurales y péptidos autoensamblables en lesiones experimentales de la médula espinal cervical. J. Vis. Exp. (2015).

Este protocolo demuestra un enfoque de inyección dirigida para la reparación de lesiones de la médula espinal en un modelo de rata. Implica la administración de péptidos autoensamblables (SAP) en el núcleo de la lesión para crear un andamio de soporte, seguido de inyecciones de células precursoras neurales (NPC) alrededor de la lesión para remodelar el tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Modelo de contusión / compresión de aneurisma cervical

1. Antes de la cirugía, esteriliza los instrumentos en autoclave y mantenlos estériles durante todo el procedimiento quirúrgico poniéndolos en un baño de alcohol al 70%.
2. Anestesiar ratas Wistar (250-270 g) con una combinación de oxígeno (O₂), óxido nitroso (N₂O) (1:1) e isoflurano al 1,8-2,2% y apoyar la respiración espontánea a través de una máscara de anestesia con gas. Para la inducción de la anestesia, comience con isoflurano al 5% durante 1 minuto y reduzca después. Antes de comenzar la cirugía, controle la profundidad de la anestesia dando un estímulo doloroso (por ejemplo, en las patas). Aplicar ungüentos grasos en los ojos para evitar la sequedad y prevenir infecciones posteriores.
3. Coloque las ratas en un cojín calefactor (37 °C) y fije la cabeza en un marco estereotáctico.
4. Afeitar la región quirúrgica alrededor de la columna cervical y desinfectar con povidona yodada y alcohol al 70%.
5. Hacer una incisión en la línea media por encima de la columna vertebral desde la vértebra cervical (C2) hasta el proceso prominente del cuerpo vertebral torácico 2 (T2).
6. Corte la capa externa de los músculos vertebrales directamente en la línea media (para evitar sangrado) en dirección cráneo-caudal y diseccione aún más las capas musculares más profundas sin rodeos hasta llegar al proceso espinoso y las láminas. Inserte retractores.
7. Oriente el proceso espinoso prominente del cuerpo vertebral T2 para observar los niveles objetivo para la laminectomía. Después de la identificación y preparación microquirúrgica de las láminas seleccionadas, corte los ligamentos flavae para aflojar las láminas y el proceso espinoso. Finalmente, corte las láminas con un cortahuelas lateral a la médula espinal y retírelas suavemente, evitando cualquier compresión de la médula espinal en sí.
   NOTA: Los niveles más comunes son C5/6, C6/7 o C7/T1. La tasa de mortalidad perioperatoria aumenta cuanto más rostral es el nivel de lesión. El sangrado del seno venoso paravertebral es común y se puede tratar mediante una compresión cuidadosa con una esponja.
8. Antes de insertar el clip para traumatizar la médula, identifique las raíces nerviosas emergentes para evitar que se corten (especialmente en los niveles C5/6).
9. Para garantizar una inducción suave del clip, afloje la duramadre ventral del lado dorsal de los cuerpos vertebrales con un gancho y prepare un corredor para el clip.
10. Finalmente, inserte el clip abierto y déjelo cerrar (cierre rápido) para lograr una lesión por contusión. La fuerza de cierre del clip y la duración del cierre del clip determinan la intensidad del trauma y el grado de compresión. Comúnmente se utilizan fuerzas de recorte de entre 15-35 g y una duración de recorte de, por ejemplo, 1 min. (Figura 1).
11. Después de retirar el clip, adapte los músculos en 2 capas y cierre la herida.
12. Detenga la anestesia y deje que el animal se despierte bajo su observación continua hasta que recupere la conciencia suficiente para la decúbito esternal. Finalmente, coloque a la rata en una sola jaula y siga las pautas de tratamiento postoperatorio.
13. Dado que los animales luchan con la gravedad de este tipo de lesión, debe prestar especial atención a los tratamientos postoperatorios:
    1. Administrar analgésicos (Buprenorfina y Meloxicam durante 3 y 5 días, respectivamente, y según los síntomas clínicos).
    2. Administre solución salina adicional por vía subcutánea durante 3 días (2 veces al día, 5-10 mililitros (ml)).
    3. Proporcione antibióticos en el agua potable 2 días antes y hasta 7 días después de la cirugía (p. ej., moxifloxacina)
    4. Apriete la vejiga urinaria 2-3 veces al día hasta que la recuperación de la función de la vejiga sea constantemente evidente.
    5. Observar los déficits neurológicos y el estado fisiológico de los animales operados al menos una vez al día.

2. Inyección de SAP y NPC (14 días después de la lesión)

1. Induzca la anestesia como se describe en 1.1 a 1.3, fije la cabeza de la rata en un marco estereotáctico, retire los puntos o los clips de la herida y desinfecte la herida y el área quirúrgica con povidona yodada y alcohol al 70%.
2. Diseccionar cuidadosamente los músculos paravertebrales, insertar retractores, eliminar el tejido cicatricial microscópicamente de la duramadre y volver a exponer el sitio de la lesión.
3. Prepare las PAS en una concentración del 1% (p/v) para realizar un gel de matriz extracelular. Los SAP QL6 tienen un pH fisiológicamente compatible y no necesitan ser amortiguados antes de la inyección. Para la visualización de los SAP en la médula espinal, use un derivado fluorescente de QL6 (isotiocianato de fluoresceína QL6 [FITC]).
4. Inyecte PAS (5 microlitros (μl) en el centro de la lesión, distribuidos en 2 porciones, cada una de 2,5 μl bilateralmente de la línea media. Utilice una jeringa Hamilton conectada al marco estereotáctico con un capilar de microvidrio (100 micrómetros (μm) de diámetro exterior [OD]). Abra la duramadre con cuidado con la punta de una aguja afilada e inserte el capilar de vidrio estereotácticamente 2 milímetros (mm) en la médula espinal traumatizada.
5. Después de inyectar 1/3 del volumen, retire la aguja a 1,5 mm de profundidad y después de 1/3 a 1 mm más. Después de la inyección de todo el volumen, y antes de retirar la jeringa, espere 5 minutos para estabilizar la formación de gel.
6. Para generar NPC, use ratones adultos con proteína fluorescente roja discosoma (DsRed) (o ratones positivos para proteína fluorescente amarilla [YFP], verde) y aíslelos y cultive de la zona paraventricular.
7. Evalúe la viabilidad de las NPC mediante la tinción con azul de tripano, que indica la presencia de ~ 90% de células vivas en la suspensión celular. Diluir las células en un medio de cultivo (50 x 10³ células vivas/μl) y luego utilizarlas para el trasplante de células.
8. Realizar cuatro inyecciones intraespinales de 2 μl (8 μl de volumen total, que contienen 4 x 10⁵ NPC) bilateralmente a 2 mm rostral y caudal del sitio de la lesión. Después de abrir la duramadre, inserte el capilar de microvidrio Hamilton 1,5 mm por debajo de la superficie dorsal de la médula espinal e inyecte 2 μl de la suspensión celular. Elija una velocidad de inyección de aproximadamente 0,5 μl / min (min).
9. Al final de cada inyección y antes de retirar el capilar del cordón, espere al menos 1 minuto, permitiendo que el tejido se estire para acomodar el nuevo volumen celular. (Figura 2)

Resultados

Figura 1: Modelo de aneurisma de compresión/contusión de clip. (A) Fotografía a través del microscopio quirúrgico después de la laminectomía de C7 / T1 y contusión / compresión de clip de la médula espinal de una rata.

Materiales