Manipulación optogenética de circuitos neuronales para la transición del sueño a la vigilia en ratones

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Cirugía animal, inyección de virus, electrodo para EEG / EMG e implantación de fibra óptica

PRECAUCIÓN: Se deben seleccionar técnicas adecuadas de protección y manipulación en función del nivel de bioseguridad del virus que se utilizará. El virus adenoasociado (AAV) debe usarse en una sala aislada de grado P1A para inyección, y el tubo que transporta AAV debe esterilizarse con un autoclave después de que se agote todo el volumen. El sitio quirúrgico y todo el material implantado deben estar limpios y estériles durante su uso.

NOTA: Consulte la Figura 1.

1. Desinfecte el equipo quirúrgico con el autoclave.

2. Anestesiar ratones con isoflurano usando un vaporizador anestésico. Observe hasta que el ratón haya alcanzado la profundidad deseada de anestesia, determinada por la pérdida de respuesta al pellizcar la cola con fórceps. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar que se sequen.

3. Desinfectar el campo quirúrgico con solución de yodo o etanol al 70% (EtOH, 3x) y secar lo suficiente. Deje que el virus se descongele en hielo mientras se realiza la cirugía. Cubra el área quirúrgica con papel de mesa de laboratorio absorbente.

4. Fije la cabeza del ratón en el aparato estereotáctico con barras para los oídos y un pellizco nasal. Después de confirmar que la cabeza se mantiene estable, haga una incisión sagital media en el cuero cabelludo para asegurarse de que las posiciones del bregma y la lambda estén ubicadas al mismo nivel en una línea horizontal.

5. Para evitar un espacio de posicionamiento, ajuste adecuadamente los niveles del pellizco nasal y las barras de los oídos hacia arriba y hacia abajo. El bregma y la lambda se refieren a la intersección entre la sutura saggitalis y la sutura coronal o la sutura lambdoidea, respectivamente (Figura 2).

6. Use pinzas Serafin para sujetar la piel y mantener el acceso al cráneo. Después de la exposición del cráneo, desinfecte la superficie del cráneo con yodo o 5% H₂O₂, para permitir que las suturas craneales, incluidos el bregma y la lambda, se visualicen con mayor claridad.

7. Prepare la inyección de vectores AAV:

1. Lave el interior de una jeringa de 10 ml (consulte la Tabla de materiales) secuencialmente con EtOH al 70%, EtOH al 100% y agua esterilizada, 5 veces cada uno. Asegure la jeringa en la abrazadera de un brazo de bomba de microinyección y asegúrese de que se descargue toda la solución de la jeringa.

2. Aspire cuidadosamente 2 μL de aceite mineral sin burbujas de aire, luego aspire el volumen designado de la solución del virus. Después de la aspiración, manipule el botón del émbolo y confirme que la solución del virus emerge en la punta de la aguja.

NOTA: El volumen de inyección de la solución de virus se determinó en experimentos piloto utilizando la misma cepa de ratón y el mismo producto de virus. La relación entre el volumen de la solución del virus y la extensión del área de infección debe estimarse de antemano.

8. Inyecte el vector AAV:

1. Ajuste la punta de la aguja de microinyección en el bregma y anote las coordenadas como el punto original. Mueva la punta al lugar de inyección designado (para el BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral ± 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) y coloque la punta de la aguja en la posición. Ponga una marca en el cráneo y taladre agujeros de aproximadamente 2 mm de diámetro con un taladro dental con un cortador de carburo de 0,7 mm. Tenga cuidado de no dañar la duramadre o el tejido cerebral.

2. Después de extraer la sangre alrededor de los agujeros con un hisopo de algodón, mueva lentamente la aguja a la posición del BNST. Inyecte lentamente la cantidad designada de solución de virus (0,07 μl/min) con un microinyector mecánico. Después de completar la inyección, deje la aguja durante 5 minutos para permitir que la solución se infiltre lo suficiente en el tejido BNST. Retire con cuidado la aguja.

3. Para inyecciones bilaterales, repita los pasos 1.8.1-1.8.2 en el otro lado. Durante todo el procedimiento, aplique solución salina estéril para mantener el cráneo húmedo.

NOTA: Utilizamos implantes personalizados de electroencefalografía (EEG) / electromiografía (EMG) (ancho: 5 mm, profundidad: 7 mm, altura: 1 mm) con cuatro electrodos de EEG (4 mm), dos electrodos EMG (2 mm; corte el electrodo de 4 mm a 2 mm con pinzas) y 6 electrodos (4,5 mm) (Figura 2A).

9. Suelde dos alambres de acero inoxidable (consulte la tabla de materiales) de los cuales se quita 1 mm del aislamiento de ambos extremos a los electrodos EMG. Ajuste el centro de los electrodos al bregma, marque la posición de cada electrodo de EEG (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm) y determine la posición del implante (Figura 2B).

10. Fibras ópticas del implante:

1. Conecte una férula de fibra óptica al manipulador y gire el brazo manipulador para que tenga un ángulo de ±30° contra una línea horizontal (este proceso solo es necesario para evitar interferencias entre electrodos y fibras ópticas, como en el caso de la estimulación BNST). Coloque la punta de fibra en el bregma y registre las coordenadas.

2. Mueve la punta a la línea de inserción objetivo y marca la posición en el cráneo. Además, coloque marcas adicionales cerca del sitio de inserción de los tornillos de anclaje. Taladre el cráneo en cada sitio con un taladro dental para insertar la fibra óptica y fijar el tornillo. Fija el tornillo en el cráneo. Tenga cuidado de no romper la duramadre ni dañar ningún tejido con el tornillo.

3. Inserte la fibra óptica suavemente hasta llegar por encima del BNST con un manipulador. La férula debe descansar sobre el cráneo restante (Figura 1B).

4. Aplique cemento dental fotocurable (consulte la tabla de materiales) para cubrir la fibra y el tornillo. El tiempo de reacción para solidificar el pegamento debe especificarse en el manual del fabricante (nuestro material necesita exposición a la luz durante al menos 10 segundos con fotogeneradores de longitud de onda específica. No es necesario secar el pegamento después de esto).

5. En este paso, asegúrese de que ningún material (tornillos o pegamento) ocupe el espacio de montaje de los electrodos. Además, evite realizar cualquier interrupción en el cemento para la férula que se conecta a la fibra óptica y al cable. Repita los pasos 1.10.1-1.10.4 en el lado opuesto para la estimulación bilateral.

11. Taladro para electrodos de EEG / EMG. Inserte las puntas de los electrodos en los orificios. Sostenga el implante y aplique adhesivo de cianoacrilato en el espacio entre el cráneo y los electrodos. Vuelva a insertar con atención para no interferir con ningún material.

12. Cubra la circunferencia de los electrodos y las fibras ópticas con adhesivo de cianoacrilato, seguido de la aplicación de acelerante de cianoacrilato sobre el adhesivo. Este paso evita causar cualquier interrupción en la zona de conexión del cable de férula a óptica y del electrodo al cable conductor (Figura 1C).

NOTA: El adhesivo de cianoacrilato y su acelerante son dañinos para el ojo del ratón. Preste atención para no causar derrames de estas sustancias químicas. Además, tenga cuidado de no tocar fuertemente los electrodos y las fibras para evitar desviaciones inesperadas inmediatamente después de la solidificación del adhesivo.

13. Exponga los músculos del cuello del ratón e inserte los cables para el electrodo EMG debajo del músculo. Ajuste la longitud del electrodo EMG para que quede ubicado justo debajo de los músculos nucales. Una conexión ligera entre la punta del electrodo y la fascia muscular es suficiente para captar la señal EMG.

14. Aplique adhesivo de cianoacrilato para rellenar los implantes y solidificar el adhesivo con líquido de aceleración. Luego, coloque el mouse sobre una almohadilla térmica para que se recupere hasta que aparezca el reflejo postural. Ajuste la temperatura de la almohadilla térmica a la temperatura corporal en reposo del animal (36,0 °C en ZT 0-12 en el caso de ratones C57BL6; no exceda los 38,0 °C).

NOTA: No se requiere un antibiótico para la cirugía estéril. Siga las pautas institucionales locales para la analgesia postoperatoria. Mantenga a los ratones en una jaula casera durante un período de recuperación de al menos 7 días.

2. Monitoreo de EEG / EMG con fotoexcitación de neuronas dirigidas en estados específicos de sueño

PRECAUCIÓN: Este protocolo incluye el uso de equipos láser de clase 3B o dispositivos LED. Los experimentadores deben conocer la información de seguridad. Se requieren gafas protectoras para los ojos.

1. Antes de conectar el cable láser a la fibra óptica, ajuste la intensidad del láser con un raspador. Ate la punta del cable láser a una fibra óptica no utilizada con una férula y confirme que no haya espacio en la unión entre la fibra y el cable.

2. Encienda el interruptor principal del láser y espere 20 minutos para que se caliente.

3. Emita el láser al verificador de intensidad y ajuste la intensidad del láser a 10 mW / mm². Cambie el modo láser a lógica de transistor y confirme que se emiten pulsos de luz desde la fibra controlada por el regulador de patrón, que se establece en 10 ms para la duración, 40 ms para el reposo, 20 veces para el ciclo y 20 veces la repetición (es decir, 20 Hz de pulsos de luz de 10 ms durante 20 s).

4. Después del período de recuperación, mueva los ratones a la cámara experimental para registrar EEG / EMG. Los ratones domésticos se mantuvieron a una temperatura constante de 23 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con comida y agua disponibles ad libitum.

5. Conecte el electrodo implantado y el adaptador de cable que está atado a un anillo deslizante para evitar enredos. Se recomienda cubrir la unión con material impermeable a la luz, como papel de aluminio, para evitar fugas de láser. Si se requiere un experimento bilateral, use un anillo colector con un accesorio bifurcado para los cables.

6. En este protocolo, evaluamos la latencia a la vigilia del sueño de movimientos oculares no rápidos (NREM) o el sueño de movimientos oculares rápidos (REM), por lo que el tiempo de grabación debe limitarse en el tiempo zeitgeber optimizado (ZT0 se define como el momento en que la luz está encendida). Este protocolo se realizó entre ZT4 - ZT10. Deje que los ratones permanezcan libremente en la cámara experimental durante al menos 1 h como aclimatación.

7. Durante el período experimental, monitoree las señales de EEG y EMG en el mismo monitor y evalúe el estado del ratón como vigilia, sueño NREM o sueño REM. Utilice el control de ganancia para cada onda para que sea más fácil distinguir cada estado.

8. Para medir la latencia del sueño NREM a la vigilia, observe el sueño NREM estable durante 40 s o el sueño REM estable durante 30 s, luego encienda el interruptor del generador de patrones para fotoestimulación (este protocolo genera 20 Hz de pulsos de luz de 10 ms durante 20 s). Confirme la emisión láser a las fibras ópticas implantadas.

9. Registre las señales de EEG / EMG hasta que el estado de sueño cambie a vigilia. Si se necesitan dos o más ensayos experimentales, limite la manipulación optogenética a una vez al día porque la fotoestimulación es una intervención artificial que podría afectar la arquitectura del sueño / vigilia.

10. Después del experimento, anestesiar profundamente y perfundir con solución salina estéril y paraformaldehído (PFA) para tomar muestras de todo el cerebro para el análisis inmunohistoquímico.

Figura 1: Procedimiento para inyectar AAV, implantar fibras ópticas e implantes de EEG/EMG. (A) Procedimiento experimental de inyección de virus. El gen ChR2 o EYFP (para control) fusionado con EYFP incorporado en un vector AAV cuya transcripción es activada por la recombinasa Cre se inyectó bilateralmente en el BNST. (B) Las fibras ópticas se insertaron hacia el BNST en un ángulo de 30 ° con respecto a la horizontal para evitar la colisión con el electrodo. Se insertaron dos tornillos a su alrededor. (C) Se implantó un dispositivo de registro de EEG / EMG después de la colocación segura de las fibras ópticas. (D) Al final de la operación, toda el área quirúrgica debe cubrirse con adhesivo de cianoacrilato y fijarse fuertemente. Asegúrese de no aplicar ningún agente en la región que conecta el electrodo y las férulas.

Figura 2: Sitios de inserción de electrodos y pines de electrodos de EEG/EMG personalizados. (A) Arriba: De los 6 pines de electrodo, los dos pines externos se reducen a 2 mm. Abajo: electrodos de EEG/EMG. (B) Estos electrodos y cables de conducción EMG se sueldan. La zona de conexión debe aislarse con cualquier aislamiento, como adhesivo de cianoacrilato. Los sitios de inserción de los electrodos son relativos al bregma (anteroposterior ± 1,5 mm, mediolateral ± 1,0 mm). Los alambres EMG se insertan debajo del músculo del cuello con la eliminación del aislamiento que protege el alambre en el sitio de inserción (1 mm).