Estimulación del nervio vago a través de electrodos del manguito del nervio periférico implantados crónicamente en ratas

Resumen

Fuente: Sanchez, C. A., et al. Preparación de electrodos de estimulación nerviosa periférica para implantación crónica en ratas. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra la estimulación del nervio vago en una rata despierta. Una rata con un electrodo de manguito nervioso periférico crónico implantado y entrenada en una tarea de prensa de palanca está conectada a un generador de estímulos a través de una tapa de cabeza implantada. El nervio vago se estimula inmediatamente después de cada pulsación exitosa de la palanca, lo que resulta en la expansión del mapa motor.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Estimular la fabricación del electrodo del manguito

1. Prepare el tubo del manguito.
   1. Con una cuchilla de afeitar, corte un trozo de tubo de polímero de 2,5 mm de longitud. Inserte las puntas de las pinzas o un clip a través del tubo y use la cuchilla para hacer un corte longitudinal a través de la pared del tubo en un lado del manguito.
   2. Retire las pinzas del tubo e inserte una aguja de coser grande a través de la línea media del manguito, perpendicular al eje largo. Inserte la aguja a través de la hendidura (arriba) y en el centro del tubo opuesto (abajo). Coloque la aguja en el tablero de espuma para sujetar el brazalete en su lugar durante los pasos de montaje restantes.
2. Coloque una sutura para asegurar el cierre del manguito durante la implantación.
   1. Inserte la aguja de coser pequeña a través de la pared del puño, en la línea media, aproximadamente a 0,5 mm de la hendidura superior de un lado. Inserte la aguja desde el interior hacia el exterior para evitar dañar el tubo del manguito. Inserte una sutura de 2 cm de longitud de 6/0 a través del ojo de la aguja y tire de la aguja a través de la pared del tubo para enhebrar la sutura en el manguito.
   2. Dejando el hilo en su lugar, retire la aguja y perfore un segundo orificio a través de la pared del tubo aproximadamente 0,5 mm por debajo del primer orificio, a lo largo de la línea media del manguito. Inserte la sutura a través del ojo de la aguja y tire de la aguja a través de la pared del tubo para volver a pasar la sutura a través del manguito.
   3. Ambos extremos del hilo de sutura ahora deben estar en el lado exterior del manguito. Ajuste la sutura para que ~ 1,5 cm se extienda desde el orificio superior y ~ 0,5 mm se extienda desde el orificio inferior.
   4. Aplique una pequeña cantidad de adhesivo de curado UV (ultravioleta) en el extremo corto de la sutura que se extiende desde el orificio inferior y tire del extremo de sutura más largo hasta que la cola inferior esté casi al ras con la pared exterior del tubo. Use la varilla UV para curar el adhesivo y mantener la sutura firmemente en su lugar.
   5. Repita los pasos 1.2.1 a 1.2.3 en el lado opuesto del brazalete.
3. Coloque los cables de platino: iridio (Pt: Ir).
   1. Use la aguja de coser pequeña para hacer 4 agujeros en la pared del puño. Cada par de orificios debe colocarse aproximadamente a 0,5 a 0,8 mm de la línea media perpendicular, con un orificio de aproximadamente 0,5 a 0,8 mm de la hendidura superior a cada lado del manguito.
      PRECAUCIÓN: Para una colocación más consistente y precisa de los cables, inserte la aguja de adentro hacia afuera para hacer todos los orificios, utilizando la colocación de la sutura como guía.
   2. Inserte la aguja de coser nuevamente, esta vez trabajando de exterior hacia interior a través del orificio de plomo 1. Inserte aproximadamente 0,5 cm de un cable Pt:Ir de 7,5 cm de longitud a través del ojo de la aguja y tire de la aguja a través del tubo para pasar el cable a través de la pared del manguito. Ajuste el alambre de modo que ~4,5 cm se extienda en el lado exterior del brazalete (Figura 1A).
   3. Inserte la aguja a través del orificio de plomo 1 nuevamente, nuevamente trabajando de afuera hacia adentro, y adicionalmente inserte la aguja a través del orificio de plomo 2 directamente frente al orificio de plomo 1. Inserte ~0,5 cm del extremo más corto (interior) del alambre Pt:Ir a través del ojo de la aguja y tire de la aguja a través del tubo para pasar el cable a través de las paredes del manguito.
      NOTA: Ambos extremos del alambre Pt:Ir ahora deben estar en el lado exterior del manguito, y se forma un bucle de alambre alrededor del borde de la hendidura y a través del orificio de plomo 1 (Figura 1B).
   4. Repita los pasos 1.3.1 a 1.3.3 para colocar el cable Pt:Ir a través de los orificios 3 y 4.
   5. Con un encendedor de butano, retire con cuidado el aislamiento de una longitud de 5 a 6 mm en el extremo de los cables Pt:Ir que se extienden desde el orificio de plomo 2 y el orificio de plomo 4.
      PRECAUCIÓN: Aísle los extremos de los cables del resto del conjunto del manguito con cuidado para evitar dañar el manguito. Use herramientas para sujetar los cables para evitar lesiones.
   6. Alinee el cable desnudo dentro del brazalete para colocar los cables en sus ubicaciones finales. Para hacer esto, tire suavemente del extremo del cable Pt: Ir que se extiende desde el orificio 1 hasta que la parte no aislada del cable quede al ras con el orificio 1. Repita con el otro cable para alinear el extremo no aislado del cable enroscado a través de los orificios de plomo 3 y 4.
   7. Aplique una pequeña cantidad de adhesivo de curado UV a los bucles de alambre en el lado exterior del manguito en los orificios de plomo 1 y 3. Use la varilla UV para curar el adhesivo y asegurar los cables en su lugar.
   8. Utilice una punta de pipeta pequeña para empujar los cables Pt:Ir no aislados contra la pared interior del brazalete. Una vez que los cables estén en su lugar, corte los extremos de los cables que se extienden desde los orificios de los cables 2 y 4 para que aproximadamente 1 mm de cable se extienda más allá del exterior de la pared del manguito.
   9. Dobla las colas de 1 mm del alambre contra la superficie exterior del brazalete, teniendo cuidado de no acortarlas. Aplique una pequeña cantidad de adhesivo de curado UV para cubrir solo las dos colas y cure el adhesivo para asegurar la colocación del cable y proporcionar aislamiento eléctrico.
      PRECAUCIÓN: Es importante cubrir completamente las superficies Pt:Ir expuestas externamente con adhesivo para aislar los cables y evitar la estimulación fuera del objetivo.
4. Asegure los cables Pt:Ir en su lugar con sutura.
   1. Retire la aguja grande con el conjunto del brazalete de la placa de espuma. Inserte una sutura de 3 cm de longitud 6/0 a través del ojo de la aguja y tire de la aguja a través del tubo para pasar la sutura a través de la parte inferior del manguito en el punto medio.
   2. Cambie a la aguja de coser pequeña para completar el enhebrado de sutura para asegurar el plomo Pt:Ir. Inserte la aguja a través del mismo orificio de la línea media, trabajando nuevamente de adentro hacia afuera para evitar la deformación del tubo y los cables. Inserte la cola exterior de la sutura a través del ojo de la aguja y tire de la aguja a través de la pared del manguito para crear un lazo de sutura alrededor del borde del manguito (Figura 1C).
      NOTA: Use fórceps y trabaje bajo el microscopio para asegurarse de que la sutura esté orientada a lo largo del eje largo del manguito y quede plana contra el tubo. Este paso asegura que los cables permanezcan separados en el lado interior del manguito y se mantengan en su lugar lateral a la línea media del manguito.
   3. Cree un segundo lazo alrededor del extremo opuesto del brazalete atando los extremos de la sutura en un medio nudo, en el lado exterior del brazalete. Asegúrese de que la sutura corra a lo largo del eje largo del manguito y quede plana contra el tubo. Mientras mantiene el nudo apretado para que quede plano contra el tubo, aplique una pequeña cantidad de adhesivo de curado UV al medio nudo y cure para mantenerlo en su lugar.
   4. Corta con cuidado los extremos del hilo de sutura lo más cerca posible del nudo. Si es necesario, use una pequeña cantidad de adhesivo de curado UV adicional para pegar los extremos cortos de la sutura para que queden planos contra el tubo (Figura 1D).
5. Suelde los pines del conector a los cables Pt:Ir.
   1. Con un encendedor de butano, retire el aislamiento de ~3 mm al final de cada uno de los cables Pt:Ir. Suelde el lado de la copa de un pasador de oro (consulte la Tabla de materiales) al extremo no aislado de cada cable.
6. Pruebe la impedancia del dispositivo ensamblado.
   1. Conecte los pines dorados a las entradas de un medidor LCR (Inductancia (L), Capacitancia (C) y Resistencia (R)) o un módulo de verificación de impedancia de electrodo y establezca la frecuencia de prueba en 1 kHz. Sumerja el tubo del manguito (y los contactos de estimulación Pt:Ir en el interior del manguito) en un pequeño vaso de precipitados lleno de solución salina, teniendo cuidado de mantener secos los pines de plomo de oro y los conectores de la sonda. Verifique que el manguito ensamblado tenga una impedancia a 1 kHz de menos de 2 kΩ antes de proceder con la implantación.
      NOTA: La alta impedancia a menudo indica un área de superficie Pt:Ir inadecuada expuesta, que puede surgir debido a factores como la eliminación insuficiente del aislamiento, la aplicación accidental de adhesivo en el interior del manguito, hilos de alambre rotos, etcetera. Los manguitos también deben inspeccionarse en busca de hilos de alambre rotos o mal colocados que puedan provocar cortocircuitos con el uso prolongado.

2. Construcción de la tapa de la cabeza

NOTA: Los procedimientos de ensamblaje de la tapa de la cabeza son similares a los publicados anteriormente y se resumen aquí para mayor comodidad.

1. Ensamble la tapa
   1. Corte dos piezas pequeñas de envoltura de alambre de 30 AWG (American Wire Gauge), una de ~13 mm de largo y otra de ~10 mm de largo. Pele los ~1,5 mm de aislamiento de cada extremo de ambos cables. Suelde el lado del pin de un pin dorado a un extremo de cada cable, lo más cerca posible de la copa. Use cortadores de alambre para cortar el exceso de longitud del pasador más allá de la junta de soldadura.
   2. Suelde los otros extremos de los cables AWG a las dos copas de soldadura centrales de un conector microstrip de 4 pines.
   3. Doble los cables de la tapa del cable hacia el conector y coloque los pines dorados planos contra el conector, paralelos entre sí, como se muestra en la Figura 2A. El pin conectado al cable más corto debe colocarse debajo del pin conectado al cable más largo. Use acrílico para uñas, cemento dental o adhesivo de curado UV para asegurar los cables de la tapa de la cabeza en su lugar.

3. Uso

1. del dispositivo Implante los electrodos del manguito para la estimulación crónica del nervio vago.
   NOTA: Todos los procedimientos quirúrgicos deben realizarse con una técnica estéril o aséptica bajo anestesia adecuada, de acuerdo con las Pautas de los NIH (Institutos Nacionales de Salud) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y con la aprobación local de IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales). Los siguientes procedimientos están destinados a ilustrar un uso representativo del dispositivo y no pretenden ser exhaustivos.
   1. Coloque la rata en un marco estereotáxico y haga una incisión sagital sobre los huesos parietal y occipital para revelar la superficie del cráneo para la implantación de la tapa / conector de la cabeza. Taladre con cuidado 4 agujeros en el cráneo y coloque los tornillos del joyero. Use acrílico dental para asegurar la tapa de la cabeza al cráneo y los tornillos.
   2. Retire la rata del marco estereotáxico y colóquela sobre su lado derecho. Haga una incisión vertical en la piel del lado izquierdo del cuello y diseccione cuidadosamente el nervio vago izquierdo de la arteria carótida, ubicada entre los músculos esternomastoideo y esternohioides y debajo del músculo omohioideo.
   3. Túnel que el manguito conduce subcutáneamente hacia el cráneo. Conecte los cables a la tapa de la cabeza con los pasadores dorados.
   4. Coloque el nervio vago dentro del manguito y asegure el dispositivo cerrado haciendo un nudo doble en las suturas del manguito. Tenga cuidado de evitar dañar el nervio durante la implantación manipulando el nervio con ganchos romos y no conductores o agarrando el tejido conectivo que rodea el nervio.
   5. Pruebe el implante aplicando estimulación al dispositivo (tren de 10 s de 0,8 mA, 30 Hz, pulsos bifásicos de 100 μs). La implantación adecuada dará como resultado el cese de la respiración y una caída en SpO₂ (saturación de oxígeno capilar periférico) del 5% o más.
   6. Cubra los clavos de oro y los cables expuestos con acrílico dental, cierre las heridas con suturas y limpie los sitios de incisión con solución salina, alcohol y povidona yodada.
   7. Proporcionar líquidos de reemplazo, analgésicos y atención posoperatoria de acuerdo con las pautas de los NIH y la aprobación de IACUC.
2. Estimular el nervio vago durante el comportamiento despierto.
   NOTA: Se ha demostrado previamente que la administración de VNS (estimulación del nervio vago) a medida que los animales realizan tareas motoras específicas expande la representación del mapa motor de la musculatura relevante para la tarea. Utilizamos este paradigma validado para proporcionar un ejemplo representativo del uso del dispositivo, pero muchos otros paradigmas de comportamiento y/o parámetros de estimulación pueden ser relevantes para aplicaciones alternativas. Las ratas fueron entrenadas para ser competentes en la tarea de prensa de palanca utilizada aquí antes de la implantación del dispositivo. Después de la cirugía, se volvió a verificar el buen rendimiento antes de la administración de VNS: las ratas realizaron al menos 100 ensayos exitosos en dos sesiones de entrenamiento de 30 minutos por día. VNS se combinó con prensas de palanca correctas durante 10 sesiones de entrenamiento posteriores durante 5 días.
   1. Conecte la rata a un generador de estímulos a través de una tapa de cabeza implantada y ajústela a la configuración de estimulación adecuada. Para la reorganización inducida por VNS del mapa cortical motor, empareje cada prensa de palanca correcta con un solo tren de 15 pulsos bifásicos, cada uno con un ancho de 100 μs y una amplitud de 800 μA, administrado a una frecuencia de 30 Hz.
   2. Se administra un tren de estimulación inmediatamente después de la detección de cada presión de palanca exitosa a lo largo de diez sesiones de entrenamiento de 30 minutos. Durante la administración de VNS, use un osciloscopio para monitorear la administración exitosa de la estimulación actual.
3. Valide la función del manguito implantado crónicamente.
   1. Dentro de las 24 h posteriores a la última sesión de entrenamiento emparejada con VNS, use la microestimulación intracraneal (ICMS) para cuantificar el mapa somatotópico funcional en la corteza motora.
   2. Después de la inducción de la anestesia para el mapeo ICMS de la corteza motora, valide la función del manguito nuevamente aplicando un tren de 10 s de 30 Hz, estimulación de corriente de 0,8 mA (pulsos bifásicos de 100 μs), lo que debería resultar en un cese de la respiración y una reducción de los niveles de SpO₂ de al menos el 5%, consistente con el reflejo de Hering-Breuer.
      NOTA: Dependiendo de la aplicación, la función del manguito puede considerarse aceptable si se observa una caída confiable de SpO₂ de menos del 5% o si amplitudes de corriente más altas (hasta 1,6 mA) producen de manera confiable al menos una reducción del 5% en SpO₂. La falta de observación de un cese de la respiración y/o una disminución fiable de la SpO₂ es indicativo de fracaso del implante.

Resultados

Figura 1: Ensamblaje de los electrodos estimulantes del manguito. (A) Después de asegurar las suturas a ambos lados del manguito, se puede enhebrar alambre Pt:Ir a través de la pared del manguito en el orificio # 1 (punta de flecha blanca) co...

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