Transferencia de genes mediada por virus al núcleo coclear dorsal del ratón para estimulación auditiva inducida por luz

Resumen

Fuente: Kozin, E. D., et.al. Visualización directa del núcleo coclear dorsal murino para la estimulación optogenética de la vía auditiva. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra la transferencia de genes mediada por virus al núcleo coclear dorsal (DCN) del ratón para permitir la estimulación auditiva inducida por la luz. Un vector viral que codifica opsina, un canal iónico sensible a la luz, se inyecta en el DCN después de una craneotomía y aspiración cerebelosa para acceso directo. Las opsinas expresadas permiten que las neuronas se activen con la luz, proporcionando un modelo para estudiar las respuestas de las vías auditivas utilizando la optogenética.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Aspiración cerebelosa

1. Con una succión francesa 5, aspire la porción más lateral del cerebelo izquierdo que recubre la DCN hasta que la DCN sea visual (Figura 1, Panel derecho). Extirpe aproximadamente de 1/4 a 1/3 del cerebelo izquierdo. El principal hito adyacente a la DCN es la ampolla del canal semicircular superior.
   NOTA: La aspiración del cerebelo es el paso clave del protocolo. La aspiración dirigida del cerebelo se realiza con más éxito si ocurre en un solo intento y no con múltiples pasadas de succión, ya que esto causará sangrado. Para ayudar en la aspiración, coloque el plano focal del microscopio a la profundidad esperada del CN, que será ligeramente distal a la superficie del cerebelo. Establecer el plano focal en el CN mejorará la visualización y garantizará una imagen nítida.
2. Después de la aspiración, se espera un sangrado adicional, acumulación de líquido cefalorraquídeo (LCR) y desplazamiento del cerebelo en la DCN. Instilar 0,5 cc de solución salina estéril rápidamente en la craneotomía para prevenir la coagulación de la sangre. A continuación, se puede utilizar una combinación de frotado suave con una punta dental y succión para despejar el camino para la visualización directa de la DCN. No entre en contacto directo con la superficie del DCN.

2. Microinyección de presión para la transferencia de genes mediada por virus y la recuperación quirúrgica

1. Una vez que el DCN esté libre de sangre y LCR suprayacentes y sea claramente visible, realice microinyecciones de presión en el DCN con una jeringa Hamilton de 10 μl durante un período de 2 minutos.
2. Introduzca la aguja con un micromanipulador hasta que la punta ya no sea visible debajo de la superficie del DCN.
3. Para un rendimiento óptimo, use una aguja de calibre 33 o 34 (use una jeringa hermética al gas con la aguja de calibre 34) con un bisel poco profundo, como 45 °, para minimizar el traumatismo contundente y localizar el volumen de inyección dentro de la DCN, que es una estructura delgada y poco profunda del tronco encefálico (<300 μm de espesor).
   NOTA: Se pueden utilizar otros instrumentos de microinyección. Idealmente, el instrumento de inyección debe ser lo suficientemente flexible como para permitir una ligera flexión si es necesario para apuntar directamente al DCN. Además, a medida que el ratón se mueve ligeramente durante el procedimiento debido a la respiración, el instrumento debe ser lo suficientemente robusto como para soportar pequeñas cantidades de movimiento.

3. Recuperación quirúrgica

1. Inmediatamente después de la inyección, vuelva a aproximar la piel y permita que el ratón se recupere según el procedimiento de recuperación estándar. El cerebelo restante y el tejido cicatricial llenarán la cavidad causada por la aspiración del cerebelo. Monitoree constantemente a los animales hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Controle la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la capacidad de alimentarse.
   NOTA: Ningún animal que se haya sometido a una cirugía es devuelto a una jaula con otros animales hasta que se recupere por completo.
2. Si un ratón comienza a caminar en círculos después de la operación (<5% de los casos), generalmente de 2 a 4 horas después del cierre de la incisión en la piel, sacrifique inmediatamente al ratón, ya que probablemente tendría dificultades para alimentarse. Es probable que este efecto secundario se deba a la aspiración del cerebelo. El animal debe ser monitoreado para detectar dolor después de la operación y se deben administrar los narcóticos apropiados para garantizar la comodidad del animal según los estándares institucionales. Los antibióticos pueden ser necesarios, si hay evidencia de infección.

Resultados

Figura 1: La aspiración cerebelosa parcial demuestra el acceso al núcleo coclear dorsal. Panel izquierdo: Después de colocar el ratón en el soporte, se realiza una incisión vertical a través de la piel y el tejido blando a lo largo de la cara po...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Soporte estereotáxico	Stoelting	51500
5 Succión francesa	Simetría Puntos quirúrgicos	2777914
dentales	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 μl Jeringa Hamilton	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Herramientas quirúrgicas finas Rongeurs		16021-14