Regeneración axonal en el nervio ciático de un ratón después de una lesión por aplastamiento

1. Materiales y reactivos

1. Animales
   1. Utilice ratones CF1 hembras de seis semanas de edad que pesen entre 30 y 35 g para los experimentos.
      NOTA: Los ratones se alojaron en grupos (5 ratones por jaula) en jaulas esterilizadas ventiladas individualmente con cama de mazorca de maíz de 1/4" y nidos cuadrados de 2" para anidar. Las jaulas se mantuvieron en un ciclo controlado de luz-oscuridad de 12 h y la temperatura ambiente estuvo entre 19,4 °C y 25 °C. Los ratones fueron alimentados con una dieta global para roedores y un sistema automático de suministro de agua.
2. Instrumentos
   1. Utilice los siguientes instrumentos quirúrgicos para realizar la cirugía de manera eficiente: jeringas desechables (27 G, 1,0 ml) para inyección intraperitoneal, cortapelos, microscopio de disección estereoscópica, pinzas de microcirugía, tijeras de microcirugía y esponjas de hueso pequeño y esponjas no tejidas esterilizadas.
      NOTA: Todos los instrumentos y materiales son esterilizados en autoclave antes de la cirugía o preesterilizados por los productores. Durante la cirugía, los instrumentos se rocían con alcohol al 75% para mantener la esterilidad.
3. Soluciones anestésicas
   1. Use la solución anestésica #1 para inducir la anestesia y use la solución anestésica #2 antes de la inyección de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) para mantener la anestesia.
      1. Para hacer la solución anestésica #1, diluya la ketamina y la xilacina en solución salina estéril a una concentración final de 10 mg/ml y 1,2 mg/ml.
      2. Para hacer la solución anestésica # 2, diluya la avertina en solución salina estéril a una concentración final de 20 mg / ml.
4. Plásmido de ADN y oligos
   1. Prepare los plásmidos utilizando el kit comercial siguiendo los protocolos del fabricante en consecuencia. Diluir los ADN plasmídicos en agua desionizada estéril a una concentración de 2,0 μg/μL.
   2. Agregue una solución de colorante Fast Green para alcanzar una concentración final de 0,005 a 0,01% (v/v) para una mejor visualización del contorno de DRG durante la inyección.
   3. Disuelva el pequeño ARN interferente (siRNA) o los oligonucleótidos de microARN (oligos de microARN) en los tampones correspondientes proporcionados por los fabricantes para alcanzar una concentración final de 50 μM.
5. Pipeta de microinyección
   1. Tire del vidrio capilar con el extractor de micropipetas y corte la punta de la pipeta de vidrio capilar extraída con unas tijeras de microcirugía para generar una abertura con un diámetro exterior aproximado de 50 μm. A continuación, esterilice la pipeta de vidrio bajo luz ultravioleta en un banco limpio durante aproximadamente 20-30 minutos.
   2. Monte la pipeta de vidrio esterilizada en el soporte de la pipeta conectado a un sistema de dispensación de microinyección intracelular. Establezca los parámetros del sistema de microinyección a 30 psi de presión y 8 ms de duración.
6. Sistema de electroporación
   1. Conecte los electrodos al sistema de electroporación de onda cuadrada y establezca los siguientes parámetros: pulsos de 15 ms a 35 V con intervalos de 950 ms para electroporación in vivo.
7. Solución de perfusión y fijación
   1. Disuelva el polvo de paraformaldehído (PFA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración del 4% (p/v). Almacenar la solución de PFA a 4 °C.

2. Procedimientos experimentales

1. Exposición quirúrgica de los DRG L4 y L5
   1. Anestesiar al ratón mediante una inyección intraperitoneal de la solución anestésica #1 preparada previamente (con ketamina 100 mg/kg de peso corporal y xilacina 12 mg/kg de peso corporal).
   2. Afeite el área quirúrgica con el cortapelos.
      NOTA: Dado que habrá otra cirugía para el aplastamiento del nervio ciático izquierdo, el pelaje de la parte posterior del muslo izquierdo se puede afeitar simultáneamente.
   3. Coloque el ratón sobre la manta térmica (35,0 °C) y controle la temperatura rectal con una sonda de temperatura.
   4. Para probar la anestesia, pellizque los dedos de los pies y la cola del ratón y observe las respuestas conductuales.
   5. Pega con cinta adhesiva las cuatro extremidades del ratón en el tablero de corcho.
   6. Limpie el área quirúrgica con una solución de yodóforo y luego use alcohol al 75% para eliminar el yodóforo antes de cortar la piel.
   7. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
   8. Antes de la incisión, marque ambos lados de las crestas ilíacas con un rotulador fino. Dibuje una línea que conecte los dos puntos de las crestas ilíacas para facilitar la identificación de las posiciones de los GRD L5.
   9. Haga una incisión de 3 cm a lo largo de la línea media de la espalda baja con microtijeras. Además, separe los músculos paraespinosos, como el musculo multífido y el musculo longissimus lumborum, de las apófisis espinosas L3 a S1, y exponga las articulaciones facetarias de L4-5 y L5-6.
   10. Utilice un micro-rongeur para eliminar las articulaciones facetarias de L4-5 y L5-6. Además, retire el arco neural izquierdo de L4 y L5 para exponer el lado dorsal de los GRD.
2. Inyección de DRG
   1. Inyecte una solución anestésica #2 (con avertin 200 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal para mantener la anestesia antes de la inyección de DRG.
   2. Cargue los plásmidos de ADN u oligos de ARN (1 μl por DRG) en la pipeta capilar de vidrio.
   3. Inserte la punta de la pipeta de vidrio capilar con cuidado en el DRG.
   4. Inyecte gradualmente una solución de 1,0 μL de plásmidos de ADN u oligos de ARN en el GRD utilizando los sistemas de dispensación de microinyección intracelular (30 psi, 8 ms).
      NOTA: La duración de la inyección no debe durar menos de 5 minutos.
3. Electroporation
   1. Deje caer PBS en las puntas de los electrodos.
   2. Limpie el sangrado con una gasa de algodón cuadrada esterilizada.
   3. Pellizque suavemente el DRG objetivo con los electrodos y aplique 5 pulsos eléctricos cuadrados con el sistema de electroporación.
   4. Cierre las capas de músculo y piel respectivamente con suturas de nailon 5-0.
   5. Coloque al ratón sobre una manta térmica (35,0 ° C) bajo mucha atención hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Regrese el ratón a la jaula de casa después de que se haya recuperado completamente de la anestesia.
      NOTA: El ratón tarda aproximadamente 60 minutos en recuperarse completamente de la anestesia en la manta de 37 °C. Disuelva una pastilla (200 mg) de ibuprofeno en 1.000 ml de agua (0,2 mg/ml) para la alimentación diaria para aliviar el dolor posquirúrgico.
4. Aplastamiento del nervio ciático
   1. Dos o tres días (dependiendo del diseño experimental) después de la electroporación con GRD, anestesiar al ratón por vía intraperitoneal con solución anestésica #2 (con avertin 400 mg/kg de peso corporal).
   2. Pega con cinta adhesiva las cuatro extremidades del ratón en el tablero de corcho.
   3. Haga una incisión de 1 cm 0,5 cm hacia el lado izquierdo a lo largo de la línea media. Corta los músculos, como el músculo glúteo mayor y el músculo piriforme, longitudinalmente. Exponga el segmento del nervio ciático entre el foramen ciático mayor y la muesca ciática.
   4. Aplaste el nervio con fórceps de microcirugía durante 12 s y marque el sitio del aplastamiento con una sutura epineural de nailon 10-0. Haga un nudo en la membrana dural para marcar el sitio del aplastamiento.
   5. Cierre las capas musculares y de piel con sutura de nailon 5-0.
   6. Coloque al ratón sobre una manta térmica (35,0 ° C) con mucha atención hasta que haya recuperado completamente la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Regrese el ratón a la jaula de casa después de que se haya recuperado completamente de la anestesia.
      NOTA: El ratón tarda aproximadamente 60 minutos en recuperarse completamente de la anestesia en la manta de 37 °C. Disuelva una pastilla (200 mg) de ibuprofeno en 1.000 ml de agua (0,2 mg/ml) para la alimentación diaria para aliviar el dolor posquirúrgico.
5. Perfusión de ratón, DRG y recolección del nervio ciático
   1. Dos o tres días después del aplastamiento del nervio ciático (según el diseño experimental), anestesiar al ratón por vía intraperitoneal con la solución anestésica #2.
   2. Perfundir el ratón transcardialmente con PBS (pH 7,4) seguido de paraformaldehído (PFA) al 4% helado (pH 7,5) en PBS.
   3. Después de la perfusión, separe los DRG junto con las raíces nerviosas y el nervio ciático antes de la rodilla con cuidado con microtijeras y microfórceps bajo el microscopio de disección. Coloque el nervio ciático directamente en PFA al 4% durante la noche a 4 °C.
6. Obtención de imágenes y medición de los axones sensoriales marcados con fluorescencia
   1. Retire el tejido y la membrana adheridos al nervio ciático fijo con microtijeras y micropinzas cuidadosamente bajo el microscopio de disección. Luego, cambie el PFA al 4% con PBS y lave el nervio tres veces.
   2. Coloque el nervio ciático en un tobogán y manténgalo recto. Agregue 80 μL de solución antidecoloración alrededor del nervio, luego coloque un cubreobjetos sobre él. Aplana todo el tejido montado con presión.
   3. Coloque los tejidos aplanados en el microscopio epifluorescente invertido equipado con un accesorio para la adquisición de mosaicos y el procesamiento de imágenes.
      NOTA: Las longitudes de excitación y emisión son de 488 nm y 509 nm. También es posible tomar varias imágenes superpuestas manualmente y unir las imágenes usando ImageJ con el complemento Mosaic.
   4. Al medir la longitud de los axones regenerados, rastree todos los axones identificables marcados con fluorescencia en el nervio ciático desde el sitio de aplastamiento (marcado con la sutura epineural 10-0) hasta los extremos de los axones distales.