Administración dirigida de fármacos en un modelo de ratón mediante inyección de cisterna magna

En este artículo

Resumen

Fuente: Zamboni, M., et al., Inducción de la modificación de las células leptomeníngeas mediante inyección intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra el procedimiento de administración de un fármaco inductor en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La inyección induce selectivamente la expresión de marcadores fluorescentes en las células de la superficie cerebral accesibles a través del líquido cefalorraquídeo, confirmado por imágenes de fluorescencia.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Posicionamiento del animal para el procedimiento

Fije la cabeza del animal en el soporte para la cabeza. Para mejorar la accesibilidad a la cisterna magna, coloque el cuerpo del animal aproximadamente a 30° de la superficie de la mesa y la cabeza inclinada hacia abajo, para establecer un ángulo de 120° con el resto del cuerpo y extienda la parte posterior del cuello para facilitar el acceso a la cisterna magna (Figura 1A).
Agregue toallas de papel debajo del animal para sostener su cuerpo durante todo el procedimiento.
Asegure la administración de anestesia a través de la boquilla y reduzca la concentración de isoflurano al 2,5% y el suministro de aire a 200 ml / min.
Aplique ungüento oftálmico.

2. Exposición de la Cisterna Magna

Afeitar la parte posterior del cuello del animal e higienizar el área con etanol al 70% y Betadine.
Con unas tijeras quirúrgicas, realice una incisión en la línea media (aprox. 7 mm de longitud) comenzando a nivel del hueso occipital y extendiéndola posteriormente.
Separe suavemente el tejido conectivo superficial y los músculos del cuello, tirando hacia los lados desde la línea media con pinzas de punta fina. Esto expondrá la membrana dural que se superpone a la cisterna magna, en forma de triángulo invertido.
Use lanzas de absorción estériles o hisopos de algodón para controlar cualquier sangrado resultante.
Coloque un pequeño separador quirúrgico para mantener los músculos del cuello a un lado y permitir la visualización de la cisterna magna durante todo el procedimiento.

3. Inyección intracisternal

Para acceder a la cisterna magna, identifique el extremo caudal del hueso occipital e inserte la aguja que previamente se dobló inmediatamente debajo.
NOTA: Habrá una caída repentina de la resistencia a medida que se perfore la membrana dural. Sin embargo, la punta de la aguja solo penetrará ligeramente por debajo de la superficie meníngea, gracias a su forma en forma de gancho.
Una vez perforada la duramadre, deje que la punta doblada de la aguja penetre por debajo de la superficie dural tirando suavemente de la jeringa hacia arriba y paralela al cuerpo del animal, para "enganchar" la aguja al cráneo (ver Figura 1B). Esto asegurará una mejor estabilidad y evitará que la aguja penetre más profundamente, evitando así el riesgo de dañar el cerebelo o la médula subyacente.
Inyecte el compuesto lentamente para evitar interferencias con el flujo natural del líquido cefalorraquídeo.
NOTA: Dependiendo del propósito del experimento, la velocidad de infusión puede variar. Si se requiere una velocidad de infusión lenta y constante (por ejemplo, cuando se usa el procedimiento para rastrear el movimiento del líquido cefalorraquídeo), puede ser aconsejable utilizar un sistema de microinfusión automatizado en combinación con la jeringa.
Después de la inyección, deje reposar la aguja en el sitio durante 1 minuto y retírela con cuidado. Use fórceps de punta fina para ayudar en la retracción de la aguja de su posición de gancho.
NOTA: El uso de una aguja delgada (por ejemplo, 30 G) no provoca daños sustanciales en la membrana meníngea y la consiguiente salida del líquido cefalorraquídeo. Si se requieren tamaños de aguja más grandes, recomendamos detener la fuga de líquido aplicando presión en el lugar de la inyección con una punta de algodón estéril.

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Resultados

Figura 1: Etiquetado específico de células leptomeníngeas mediante inyección intracisternal de endoxifeno. Los paneles A y B ilustran el procedimiento desarrollado para la administración intracisternal. Para...