Trasplante estereotáxico de suspensión de células neurales en un ratón con lesión cerebral traumática

Resumen

Fuente: Furmanski, O., et al. Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, las células neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos se inyectan estereotáxicamente en el borde de materia gris-materia blanca de la corteza profunda en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática. Las células trasplantadas se integran en el tejido, promoviendo la recuperación funcional y la reparación del circuito en el cerebro lesionado.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Trasplante estereotáxico de suspensión celular

1. Comience el procedimiento de trasplante celular aproximadamente 24 h después de la craniectomía.
2. Prepare el equipo de trasplante de células y los suministros quirúrgicos
   1. Llene una jeringa de punta deslizante de 1 ml con solución salina estéril para la irrigación de la herida. Coloque una aguja de 25 G en la jeringa para controlar la irrigación.
   2. Llene una jeringa de punta deslizante de 1 ml con solución de CsA (ciclosporina A) para inmunosupresión. Conecte una aguja de 25 G o más a la jeringa de CsA. Vuelva a llenar la jeringa de CsA según sea necesario entre cirugías.
   3. Prepare agujas de vidrio a partir de pipetas capilares de vidrio de borosilicato de 1,0 mm de diámetro exterior utilizando métodos estándar.
   4. Use pinzas finas para romper las puntas de las agujas a un diámetro de aproximadamente 200 μm. Asegúrese de que el eje cilíndrico de la aguja no mida más de 2,5 cm.
3. Calibre la bomba de jeringa para usarla con una jeringa de 10 μl. Introduzca un caudal de 0,2 μl/min para suministrar un volumen total de 2,0 μl.
4. Preparar la suspensión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC).
   1. Realice toda la manipulación celular en una campana BSL-2 (nivel de bioseguridad 2) de cultivo celular utilizando técnicas estándar de manipulación estéril.
   2. Prepare los cultivos celulares con anticipación de acuerdo con las condiciones estándar definidas para el tipo de célula.
      NOTA: Los experimentos que se muestran en esta demostración utilizaron varias células de fenotipo neural derivadas de hiPSC.
   3. Disociar suavemente las células en una suspensión unicelular utilizando una solución de desprendimiento celular u otro medio enzimático o químico preferido.
   4. Cuente las células en suspensión, luego diluya la suspensión a 5 x 10⁴ células/μL en medio de cultivo celular mínimo (por ejemplo, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)) en un tubo de ensayo abatible de 1,7 ml.
   5. Tenga en cuenta las siguientes notas para el trasplante:
      1. Mantenga las células en suspensión a 37 °C durante la duración de los procedimientos.
      2. Cargue la jeringa solo inmediatamente antes de realizar la inyección intraparenquimatosa
         NOTA: Si la suspensión celular se coloca de lado, la gravedad puede hacer que se asiente o se adhiera al costado de la jeringa, lo que provoca irregularidades en el número de células inyectadas.
      3. Asigne ~ 5 x 10⁵ células (suspensión de 10 μL) por ratón si realiza múltiples procedimientos de trasplante de células en un día.
5. Realice una cirugía de trasplante estereotáxico
   1. Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia conectada a un vaporizador de isoflurano con una fuente de oxígeno comprimido. Induzca la anestesia con ~3% de isoflurano a ~0,7 L/min de oxígeno.
   2. Coloque el ratón en un marco estereotáxico con un cono nasal anestésico adjunto.
      1. Fija la cabeza en su lugar con barras para los oídos y una barra de mordida, orientando la cabeza para que el hueso frontal del cráneo quede horizontal. Mantenga la anestesia al 1,5%-2% de isoflurano durante la cirugía.
   3. Realice el cuidado preoperatorio y la preparación aséptica
      1. Aplique ungüento oftálmico hidratante que contenga antibióticos en los ojos con un hisopo de algodón.
      2. Lave el sitio de la incisión con solución salina estéril para limpiar el sitio y aflojar las suturas. Aplique suavemente etanol al 70% con un hisopo de algodón para esterilizar el sitio de la incisión.
   4. Retire las suturas con pinzas finas y tijeras oftálmicas. Irrigar el sitio de la cirugía y la craniectomía con abundante solución salina estéril.
      1. Si la corteza muestra características descalificadoras, como hernia excesiva, decoloración, vascularización interrumpida o hemorragia, el animal debe ser excluido.
   5. Cargue la jeringa de trasplante celular
      1. Mueva la suspensión celular de la incubadora a 37 °C a una campana de bioseguridad de cultivo celular. Agite o golpee suavemente el tubo para asegurar una suspensión celular homogénea.
      2. Utilice una micropipeta para cargar ~7,5 μl de suspensión celular en la jeringa Hamilton a través del extremo del émbolo.
         1. Sostenga la jeringa en un ángulo de ~120° con el extremo del émbolo hacia abajo. Inserte el émbolo, teniendo cuidado de no introducir una burbuja de aire entre la suspensión y la punta del émbolo.
      3. Conecte el conjunto de juntas a la aguja de pipeta y, a continuación, conecte la aguja a la jeringa.
      4. Empuje el émbolo para mover la suspensión celular a la aguja de la pipeta. Si hay resistencia contra la salida de la suspensión, use pinzas finas para romper la punta de la aguja y agrandar el diámetro.
   6. Conecte la jeringa a la bomba de jeringa estereotáxica. Avance el émbolo para asegurarse de que el conjunto de la bomba de jeringa funcione correctamente.
   7. Mueva la aguja a las coordenadas para la inyección.
      1. Alinea la punta de la aguja con bregma. Establezca las coordenadas X e Y en 0. Luego mueva la punta de la aguja sobre la craniectomía a 2,0 mm lateral y -1,0 mm posterior al bregma. Toque la superficie de la duramadre con la punta de la aguja y establezca la coordenada estereotáxica en Z = 0.
      2. Empuje el émbolo para asegurarse de que la suspensión celular fluya adecuadamente antes de introducir la aguja en el cerebro.
      3. Introduzca la aguja en el cerebro a una profundidad de Z = -1,4 mm. Estas coordenadas estereotáxicas colocan el injerto en el borde de la materia gris-materia blanca de la corteza profunda.
   8. Encienda la bomba de jeringa para infundir la suspensión celular. Configure el temporizador de la mesa de laboratorio en 15 minutos e inicie el temporizador. Utilice un microscopio de larga distancia de trabajo para controlar el flujo de salida de la suspensión celular.
      1. Irrigar el sitio de la cirugía con solución salina estéril durante la inyección para mantener la hidratación de los tejidos.
      2. A los 15 min, retire lentamente la aguja de trasplante. Irrigar el sitio de la cirugía con solución salina y cerrar la incisión con suturas.
   9. Realice el cuidado postoperatorio
      1. Suspenda la anestesia. Administrar CsA mediante inyección subcutánea en el cogote a una dosis de 10 mg/kg. Coloque el ratón en una jaula postoperatoria limpia y precalentada.
      2. Proporcione analgésico acetaminofén en el agua potable a 1.0 mg / mL.
         NOTA: Proporcione analgesia de acuerdo con el protocolo operativo estándar (SOP) del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) apropiado y en consideración de las variables de resultado experimentales.
      3. Proporcione una jaula de recuperación de alimentos humedecidos para ayudar en la rehidratación y recuperación.
6. Continúe con las inyecciones diarias de CsA a 10 mg / kg durante la duración de la supervivencia del ratón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 ml jeringas	Becton Dickinson (BD)	309659
1,7 ml tubos de ensayo abatibles	Denville	C2170
jeringa de 10 microlitros	Hamilton	7635-01
25G Agujas de jeringa Precision Glide	Becton Dickinson (BD)	305122
70% Etanol			Producto de elección; varía según la región
Suspensión oral de acetaminofén	Tylenol (para niños)		Diluir a 1 mg/ml en agua
Vaporizador anestésico	Vetland	0521-11-22
Paño		de manipulación de animales	Compra en grandes almacenes
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
Oxígeno			Producto de elección; varía según la región
Ciclosporina A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
Cinta aislante	3M Corporation		Compra en
grandes almacenes Pinzas finas	Herramientas de ciencia fina	11254-20
Pinzas	de ciencia fina	91106-12
Pipetas capilares de vidrio, 1 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interior	World Precision Instruments	1B100F-3
Kit de Micromotor Rotativo de Alta Velocidad	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Burr Set De 5	Cell Point Scientific	60-1000
Impactador estereotáxico de impacto único para CCI	Leica Biosystems	39463920
Isoflurano	Baxter	NDC-10019-360-60
Temporizadores de banco de laboratorio	Fisher Scientific	14-649-17
Micropipeta extractor	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	Cualquier extractor será suficiente
Cubreobjetos de microscopio	Fisherbrand	12-545-E
Medio			Producto de elección
Espejo			Compra en tienda departamental
Portaagujas hemostático	Herramientas de ciencia fina	12002-12
Oftálmico ungüento	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
Tijeras de resorte oftálmico	Fine Science Tools	15018-10
Caja			de plástico Comprar en grandes almacenes
Cilindro			de plástico Comprar en grandes almacenes
Bomba de jeringa motorizada QSI	Stoelting	53311
Accesorio de compresión de aguja extraíble	Hamilton	55750-01
Marco estereotáxico pequeño para roedores	Tijeras pequeñas Stoelting	51925
	ciencia fina	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
Almohadillas de preparación de alcohol estéril	Fisherbrand	06-669-62
Hisopos de algodón estériles/Q-tips Kendall	Tyco Healthcare	540500
Solución salina estéril	Hospira	NDC-0409-1966-07
Cronómetros (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus Gold	Fisherbrand	15-188-48
Suturas - 5.0 seda con aguja curva	Oasis	MV-682

comprimido Herramientas de montaje de portaobjetos de microscopio Herramientas de