Transducción lentiviral de células progenitoras neurales para la regulación epigenética de la expresión de alfa-sinucleína

Resumen

Fuente: Tagliafierro, L., et al. Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de herramientas de edición del epigenoma en modelos de enfermedades derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la transducción lentiviral de células progenitoras neurales (NPC) para la modificación epigenética dirigida de alfa-sinucleína, una proteína clave en la enfermedad de Parkinson. El protocolo permite la metilación del ADN mediada por metiltransferasa, reduciendo la expresión de SNCA para estudiar la regulación génica y posibles intervenciones terapéuticas.

Protocolo

1. Diferenciación de células progenitoras neurales dopaminérgicas

1. Descongelación de NPC MD (células progenitoras neurales dopaminérgicas del mesencéfalo)
   1. Preparar una placa recubierta de BMM (membrana de matriz básica) y calentar N2B27 completo. Agregue 10 ml de DMEM / F12 tibio a un tubo cónico de 15 ml. Coloque un criovial en un bloque de calor a 37 °C durante 2 min.
      1. Transfiera las células del criovial al tubo que contiene DMEM/F12. Centrifugar a 300 x g durante 5 min.
      2. Aspire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 2 ml de N2B27 y agregue la suspensión celular a un pocillo de la placa recubierta de BMM. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO₂.

2. Transducción de NPC MD y análisis de cambios de metilación

1. Transducción de NPC MD
   1. Transducir NPC MD al 70% de confluencia con ARN guía LV (vector lentiviral)/vectores Cas9-DNMT3A (enzima metiltransferasa de ADN 3A) desactivados en MOI (multiplicidad de infección) = 2. Reemplace el medio N2B27 16 h después de la transducción.
   2. Añadir N2B27 con 5 μg/mL de puromicina, 48 h después de la transducción. Cultive las células durante 3 semanas en N2B27 más puromicina para obtener las líneas MD NPC estables. Las células están listas para aplicaciones posteriores (ADN, ARN, análisis de proteínas, caracterización fenotípica, congelación y paso).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipment
Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	Placas Corning	430791
de 6 pocillos	Centrífuga	3516
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Microscopio de fluorescencia invertida	Leica	DM IRB2
Reactivos
Solución antibiótica-antimicótica, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Supplement (50X), menos vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Matriz calificada por HESC Corning	Matrigel Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Medio neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049

de sobremesa Corning de cultivo celular