Transducción viral en el útero en un ratón

Resumen

Fuente: Lutz, D., et al. Evaluación de los parámetros de neuroplasticidad ultraestructural después de la transducción intrauterina del cerebro y la médula espinal del ratón en desarrollo. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra la transducción viral mediante inyección en el útero en embriones de ratón. Se prepara una rata preñada para la cirugía y se hace una incisión en la línea media para exponer los cuernos uterinos. Se inyecta una mezcla de un virus que contiene el gen deseado y un tinte de seguimiento en los embriones dentro de los sacos uterinos en los lugares objetivo. Luego, los cuernos uterinos se vuelven a colocar antes de suturar.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Transducción en el útero

:

1. Prepare el virus adenoasociado tipo 1 (AAV1) que codifica para el objetivo deseado (4 x 10¹¹ partículas virales/μL de AAV1) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4. Añadir 0,1 mg/μL Fast Green y mantener la mezcla AAV1-Fast-Green a 37 °C.
2. Prepare una punta capilar delgada con la forma deseada (8 mm de longitud, con un diámetro exterior de 80 μm y un diámetro interior de 50 μm) utilizando un extractor de micropipetas (ajustes: presión = 500, calor = 700, tracción = 0, velocidad = 80, tiempo = 200, consulte la Tabla de materiales). Romper la punta del capilar para que sea de 4-5 mm.
3. Montar un tubo aspirador (44 cm x 0,7 cm) con la punta capilar y aspirar 15 μL de la mezcla AAV1-Fast-Green en el capilar.
4. Mantenga a los sujetos animales a una temperatura corporal fisiológica constante de 37 °C durante todo el procedimiento.
5. Coloque un ratón C57Bl/6 preñado (día embrionario 14,5) en la cámara de preincubación y anestesia al ratón con isoflurano gaseoso al 4% (con un caudal de aire volumétrico de 0,6-0,8 L/min).
6. Por vía subcutánea, inyectar buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal).
7. Coloque el ratón anestesiado sobre la placa quirúrgica precalentada (37 °C).
8. Cubre los ojos con un lubricante.
9. Coloque el ratón con la máscara de anestesia (isoflurano gaseoso al 1,5 % a una tasa de flujo de aire volumétrico de 0,6-0,8 L / min) en la placa quirúrgica y afeite la región de la piel abdominal. Limpie la región afeitada con etanol 3X 75% y luego con solución de betadine.
   NOTA: Monitoree continuamente el comportamiento respiratorio del ratón anestesiado. Ajuste la concentración del gas isoflurano de acuerdo con el patrón de inhalación-exhalación del ratón.
10. Verifique la ausencia del reflejo plantar apretando las falanges de las patas traseras del ratón.
11. Abra la cavidad abdominal agarrando la piel con pinzas de iris dentadas curvas (10 cm) y cortando la piel a lo largo de la línea mediana con unas tijeras rectas de carburo de tungsteno (10 cm), y luego, agarrando la pared peritoneal con pinzas rectas Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) y cortando la pared a lo largo de la línea alba con unas tijeras rectas de Vanna (8 cm).
12. Coloque un trozo de película de parafina fenestrada en la abertura abdominal y fije la película en ambos extremos con pinzas hemostáticas de micromosquitos (12,5 cm, curvas).
13. Exponga los cuernos uterinos con un dispositivo similar a una cuchara para evitar daños a los embriones dentro de los cuernos uterinos. Gotea unas gotas de PBS (37 °C) sobre los cuernos uterinos e inspecciona los embriones en busca de daños o malformaciones dentro del saco uterino.
14. Documente el orden y la posición de los embriones en los cuernos uterinos. Gire los embriones con cuidado dentro del saco uterino hasta alcanzar la posición deseada para la inyección.
15. Inyecte 1-2 μL de la mezcla AAV1-Fast-Green inspeccionando visualmente el lugar de la inyección (p. ej., ventrículos cerebrales) y la penetración del tinte bajo un microscopio estereoscópico.
16. Documente los embriones inyectados y coloque los cuernos uterinos con los embriones inyectados nuevamente en la cavidad abdominal.
17. Gotear unas gotas de PBS (37 °C) en la cavidad abdominal. Cierre la cavidad suturando la pared peritoneal (use suturas de poliamida de tamaño 6-0) y la piel (use suturas de poliamida de tamaño 3-0) usando pinzas hemostáticas de mosquito de Halsted (12,5 cm, curvas). Alternativamente, use un patrón interrumpido simple o suturas/grapas de acero inoxidable para cerrar la cavidad abdominal y la piel.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
26Gx 1'' aguja	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Unidad de anestesia para bomba de aire	Instrumentos biomédicos (Univentor)	8323102
Virus adenoasociado serotipo 1 (AAV1)	UKE (Viral Instalación central)	-	Para referencias y áreas objetivo de AAV1, consulte: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ y también: Vectores de administración de genes de diseño: ingeniería molecular y evolución de vectores virales adenoasociados para mejorar la transferencia de genes. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar; 25(3):489-99. Los vectores virales AAV recombinantes pseudotipados con cápsidas virales de los serotipos 1, 2 y 5 muestran eficiencia diferencial y tropismo celular después de la administración a diferentes regiones del sistema nervioso central. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. Agosto de 2004; 10(2):302-17. Los vectores de virus adenoasociados recombinantes autocomplementarios (scAAV) promueven una transducción eficiente independientemente de la síntesis de ADN. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. Agosto de 2001; 8(16):1248-54.
Bomba de aire	Instrumentos biomédicos (Univentor)	Eheim 100
Conjuntos de sintonización de aspirador	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Máscara de respiración Ratón Aluminio anodizado	Instrumentos biomédicos (Univentor)	-
Ampollas	buprenorfina	Temgesic	analgésico
Capilares	Ciencia-Productos	GB100TF-10	con pinzas
(#3, 12 cm, rectas, 0,2 x 0,12 mm)	FST	11203-23
Afeitadora eléctrica	Phillips	-
Suturas Ethicon (Ethilon, 6-0 y 3-0)	Ethicon-poliamida
Lubricante ocular	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	para la visualización de líquidos inyectados
Interruptor de enrutamiento de gas Conectores 4/2	Instrumentos biomédicos (Univentor)	8433020
Pinzas hemostáticas Halsted Mosquito (12,5 cm, rectas)	FST	13011-12
Caja de inducción para ratones con tapa móvil horizontal.Dimensiones interiores: LxBxH: 155x115x130 mm.Espesor de la pared: 6 mm	Instrumentos biomédicos (Univentor)	-
Pinzas de iris (10 cm, curvas, dentadas)	FST	14007-14
Tijeras de iris (11 cm, rectas, carburo de tungsteno)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, calentadas eléctricamente, smDimensiones exteriores: 257x110x18 mm.Área de calentamiento: 190x90 mmLa extracción del isoflurano que escapa de la máscara respiratoria se realiza hacia abajo de acuerdo con las regulaciones	Instrumentos biomédicos (Univentor)	-
Isoflurano (Attane)	Anestesia médica		inhalación
Microscopio óptico Basic DM E	Leica-4x		(N.A. 0,1 ∞/-), 10x (N.A. 0,22 ∞/0,17), 40x (N.A. 0,65 ∞/0,17), 100x (N.A. 1,25 ∞/0,17) objetivos
Polea de micropipeta	Science-Products	P-97
Pinza hemostática para mosquitos (12,5 cm, curva)	FST	13010-12
Thermopuller P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 Material de tubo para la conexión de todas las piezasDiámetro exterior: 6mmDiámetro interior: 4mmEspesor de pared: 1mm	de Biomedical Instruments (Univentor)
8 cm, recta)	FST	15009-08

de Dumont de filete por JD Tijeras Vannas (