Inyección estereotáctica de hidrogel en un modelo de ratón posterior a un accidente cerebrovascular

Resumen

Fuente: Wilson, K.L., et al. Inyección de andamios de biomaterial de hidrogel en el cerebro después de un accidente cerebrovascular. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la inyección estereotáxica de un hidrogel en el núcleo del accidente cerebrovascular de un ratón después de un accidente cerebrovascular, destacando su papel en la formación de andamios que imitan la matriz extracelular, promueven la infiltración celular y apoyan la angiogénesis, lo que subraya su potencial neuroterapéutico en la recuperación del accidente cerebrovascular.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

Inyección de hidrogel u otros biomateriales

1. Realice la inyección de biomateriales en un momento definido por el usuario. En este experimento, las inyecciones se realizaron entre 5 y 7 días después del accidente cerebrovascular. Se inyectan de 2 a 6 μL de hidrogel.
   1. Encienda la almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón durante la anestesia (37 °C).
   2. Prepare tijeras esterilizadas en autoclave, fórceps, algodón, ungüento para los ojos veterinarios, pegamento quirúrgico o material de sutura, alcohol estéril y toallitas de beta-yodo. Prepare el taladro óseo con cabezales de broca estériles y las jeringas de vidrio Hamilton de 25 μL con agujas metálicas de 30 G.
   3. Encienda la esterilización con perlas a 160 °C para permitir la esterilización de instrumentos entre ratones.
   4. Conecte las bombas de inyección al dispositivo estereotáxico. Ajuste el caudal a 1 μL/min y ajuste el volumen a 4 μL.
   5. Prepare una jaula limpia para los ratones después de la cirugía.
2. Coloque el ratón en la cámara de inducción con una concentración de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que el movimiento espontáneo se detenga y su respiración llegue a un ritmo lento y constante.
   1. Una vez dormido, transfiera y asegure el mouse al dispositivo estereotáxico con una concentración de isoflurano de mantenimiento del 1,5%.
   2. Aplique el ungüento para ojos veterinarios en ambos ojos.
   3. Afeite cualquier pelaje que pueda haber vuelto a crecer de la cabeza del ratón y prepare asépticamente el área usando una toallita con alcohol seguida de una toallita de yodo beta. Repita tres veces.
      NOTA: Si es necesario, use una toallita con alcohol adicional al final para limpiar todo el beta-yodo, ya que causa irritación de la piel y hace que los ratones se piquen el cráneo después de la cirugía.
3. Con las tijeras pequeñas y / o fórceps, vuelva a abrir la piel sobre el cerebro. Use algodón con solución salina estéril o PBS (solución salina tamponada con fosfato) para limpiar cualquier residuo del cráneo. Un círculo blanco-amarillo (el trazo, Figura 1B) y el orificio de la fresa del taladro serán visibles. Si el tejido muerto no es visible, es probable que no haya ocurrido un accidente cerebrovascular. Si el orificio de la rebaba no está centrado por encima del trazo, vuelva a perforar para centrarlo.
4. Oriente la bomba de inyección sobre el ratón y bloquéela a 90°. Limpie la jeringa con solución salina estéril o PBS antes de volver a cargar el material.
   1. Una vez limpia, desmonte la jeringa de vidrio para que no quede aguja. Descargue la jeringa con una pipeta de desplazamiento positivo de 25 μl con 10 μl de hidrogel (u otro biomaterial aquí con o sin células).
   2. Con el émbolo de la jeringa, empuje el gel hasta el frente de la jeringa. Luego, vuelva a armar la jeringa y continúe empujando hasta que el gel exuda visiblemente de la aguja.
5. Coloque la jeringa en la bomba. Es posible que sea necesario ajustar la parte posterior de la bomba para que la jeringa encaje. Ajuste el caudal a 30 μL/min, seleccione Extracción o Inyectar en función de la dirección en la que deba moverse y, a continuación, pulse Iniciar. Presione Detener cuando la parte posterior de la bomba esté en la ubicación correcta.
   1. Enrosque la parte posterior de la bomba para que la jeringa quede segura. Si se realizaron ajustes previamente, asegúrese de que el caudal se vuelva a ajustar a 1 μl/min y se ajuste a la inyección.
6. Mueva la bomba en las direcciones x e y para orientarla sobre el agujero. Mueva la bomba hacia abajo en la dirección z hasta que la aguja de la jeringa toque la parte superior del orificio.
7. Reinicie la Z en la consola de visualización digital. Luego, mueva la jeringa hacia abajo en la dirección z 0,750 mm. Si la jeringa se dobla o hay resistencia, el cráneo se curó o no se perforó por completo y debe volver a perforarse.
8. Presione Start en la consola de la bomba para inyectar de 4 a 6 μL del hidrogel a una velocidad de 1 μL / min.
9. Configure un temporizador de 5 minutos cuando la bomba deje de inyectar para permitir que el gel comience a reticularse.
10. Después de 5 minutos, levante lentamente la jeringa girando el z-nob. Observa si algún material se tira accidentalmente o se filtra del agujero. Desbloquee la bomba y aléjela del ratón cuando la aguja esté lo suficientemente lejos del cráneo.
11. Con fórceps, pegamento quirúrgico o suturas, cierre la piel por encima de la cabeza. Coloque el ratón en la jaula limpia y observe su recuperación. El ratón debería tardar entre 5 y 10 minutos en recuperarse de la anestesia.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del bregma y localización del trazo. (A) Los lóbulos parietales se encuentran en la parte superior para formar el bregma. La colocación del láser se centró a 2,0 mm a la izquierda del bre...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
25uL Jeringa Hamilton 702RN, sin aguja	Jeringas de 14824663 Fishcer Scientific		utilizadas para inyectar biomateriales
Pipeta de desplazamiento positivo 25uL	Gilson	M-25
	Kopf Instrumentos	901
C57BL/6 Ratones	Jackson Laboratory	664	8-12 semanas de edad
Ensamblaje de jaula Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" de largo, diámetro 6mm, paquete de 4 - para adjuntar láser a
hisopos de algodón	VWR	89031-288
CP 25 puntas de pipeta	Placa	F148012
	Kopf Instrumentos	HP-4M
IMPAC Centro de anestesia multipaciente integrado de 6	VetEquip	901808
Fórceps Jewlers #5	GFS chemicals	46085
Miltex Adson Pinzas de apósito, grado de disección	Intefra Miltex	V96-118
Mini-bomba de flujo variable	Bomba Thomas Scientific	70730-064	para perfusiones
Soporte de cabeza de anestesia de gas de ratón	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Caja de control	Chemyx	10050
Cabezal de bomba Nanojet	Chemxy	10051	Adjuntar al dispositivo estereotáxico para inyectar biomaterial
Aguja RN 30G PT STY 3, 0.5 pulgadas	Fishcer Scientific	NC9459562
Barras de oreja sin ruptura 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Sonda rectal para ratón	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 Jeringa de insulina con marcas de 1/2 unidad 0,5 mL	VWR	10002-726	Para inyectar rosa bengala
Sistema de tinción StainTray Slide	Simport Scientific	M920-2	Para teñir portaobjetos
Dispositivo esterotáxico	Kopf Instruments	940	Instrumento estereotáxico para animales pequeños
Pinzas Adson para estudiantes -1x2 dientes	Herramientas de ciencia fina	91127-12
Pinzas finas para estudiantes - vástagos rectos/anchos	de ciencia fina	91113-10
Controlador de temperatura	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Compuesto Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Vetbond Adhesivo Tisular 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931

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