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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.
Se utilizaron ratones machos adultos C57BL/6N de ocho semanas de edad.
1. Configuración preoperatoria
- Garantice un stock adecuado de instrumentos quirúrgicos esterilizados en autoclave, equipos, medicamentos analgésicos y medicamentos anestésicos.
- Garantizar un espacio de trabajo adecuado en una mesa de operaciones.
- Prepare la mesa de operaciones utilizando una tabla de espuma quirúrgica personalizada cubierta con pañales como cama para el ratón. Fije una almohadilla térmica a la tabla de espuma con cinta médica cubierta con una gasa estéril.
- Cree retractores doblando una aguja de acupuntura con pinzas vasculares, doblándola por la mitad y luego doblando la punta de la aguja de acupuntura doblada en un gancho. Fije una tira de goma en el extremo de la aguja de acupuntura y use una chincheta para fijar el extremo de la tira de goma a la tabla de espuma.
- Calibre el microscopio estereoscópico; elija un microscopio estereoscópico con una distancia de enfoque adecuada. Cubra los botones de zoom / enfoque con papel de aluminio esterilizado para permitir que el cirujano los ajuste durante la operación. El papel de aluminio esterilizado se colocó en los botones de zoom / enfoque, lo que permitió al cirujano usarlo con guantes estériles.
2. Anestesia y preparación
del
- ratón Pesar el ratón y anestesiarlo según su peso corporal (isoflurano 3%). Asegúrese de que el ratón no responda cuando se pellizcan los espacios interdigitales de su pata para confirmar la profundidad de la anestesia. Se debe mantener una profundidad adecuada de anestesia durante todo el procedimiento (isoflurano al 1%).
- Aplique ungüento oftálmico bilateralmente en los ojos para evitar la irritación o la sequedad de la córnea durante la cirugía.
- Prepare el sitio quirúrgico afeitando el pelaje del cuello y el pecho con una maquinilla automática. Retire y limpie el cabello suelto.
- Coloque el ratón en posición supina sobre la almohadilla térmica cubierta con una gasa estéril. Mantenga la temperatura del ratón a 37 °C durante toda la operación. Fije el ratón con cinta médica para hacer que las extremidades anteriores se abduzcan horizontalmente y evitar que las extremidades traseras y la cola se muevan. Se colocó un paño quirúrgico desechable esterilizado con una abertura adecuada en los ratones.
3. Procedimiento quirúrgico
- Inyecte tramadol como analgesia preventiva (20 mg/kg, intraperitoneal o i.p.). Marque la incisión transversal en el borde superior de la clavícula. Use tres ciclos de exfoliantes alternos de solución desinfectante de yodóforo y etanol para desinfectar el sitio quirúrgico. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie antes de la cirugía.
- Trabajando bajo un microscopio, haga una incisión transversal de 4 mm a lo largo de la marca con un bisturí estéril. Amplíe la incisión durante el procedimiento según sea necesario.
- Diseccionar sin rodeos a través de la fascia subcutánea e identificar el borde inferior de la glándula submandibular. Tire de la glándula submandibular hacia arriba para exponer la fosa supraclavicular y el esternón.
NOTA: Puede haber vasos sanguíneos de pequeño calibre en esta área. El electrocauterio se puede usar para detener el sangrado. - Realice una incisión parcial de esternotomía mediana (~ 4 mm) haciendo una incisión en el esternón desde la cabeza hasta la cola a lo largo de la línea media. Proteger la pleura, el corazón y los vasos sanguíneos durante la esternotomía.
- Identifica el músculo esternohioideo. Tire suavemente del esternón con dos pequeños retractores personalizados hechos de agujas de acupuntura e identifique el músculo esternohioideo, sobre la tráquea y el esófago. Retraiga este músculo para exponer la arteria carótida, la vena yugular interna, el nervio frénico, el nervio vago, la tráquea y el esófago.
NOTA: Retraiga suavemente el esternón para evitar el neumotórax abierto. A diferencia de los humanos, el esófago del ratón no está detrás de la tráquea, sino adyacente a la tráquea en el lado izquierdo. - Identifica el plexo braquial izquierdo. En el borde lateral de la vena yugular interna izquierda, tire de la fascia y el tejido adiposo hacia afuera para exponer el plexo braquial. Busque el tronco superior, compuesto por los nervios cervicales o C5 y C6, que tienen tres ramas. Identifique el tronco medio compuesto por el nervio C7 y el tronco inferior compuesto por los nervios C8 y torácico o T1, a lo largo del tronco superior hasta la cola del ratón.
NOTA: Hay vasos sanguíneos longitudinales en la superficie del plexo braquial. Use electrocauterio para prevenir el sangrado. Al separar el plexo braquial izquierdo, proteja el canal quiloso para evitar una fístula quilosa. - Cosecha el nervio C7 izquierdo. Diseccionar la división anterior y posterior del tronco medio (nervio C7) distalmente hasta el nivel de división a cordón debajo de la clavícula y bloquear el nervio C7 con 0,1 ml de lidocaína al 2% mediante infusión local en el tronco nervioso. Reseque el nervio C7 con tijeras de resorte Vannas en sus puntos de fusión con el cordón lateral y el cordón posterior. Recorte el nervio C7 para que la longitud de cada división sea similar.
NOTA: Las divisiones anterior y posterior del nervio C7 y las divisiones anterior y posterior de los troncos superior e inferior recorren una larga distancia antes de la confluencia, por lo que el nervio C7 debe liberarse lo suficiente antes de la resección. De hecho, el nervio C7 no siempre se divide en dos divisiones; A veces, se divide en tres divisiones o incluso en cuatro en casos raros. - Retire la lámina ventralis C6 izquierda. Proteja cuidadosamente el nervio frénico y corte el músculo escaleno anterior al nivel del segmento C6 para exponer la raíz nerviosa C7. Cortar pequeñas ramas del nervio C7 que inervan el músculo paraespinal con microfórceps. Extraiga el nervio C7 suavemente y extirpe la lámina ventral C6 con cuidado.
NOTA: Hay una prominencia ósea entre el lado medial de la arteria carótida izquierda y el lado lateral del esófago. Esta prominencia ósea es la lámina ventral de la 6ª vértebra cervical. El músculo longitudinal del borde lateral de la lámina ventral C6 es el músculo escaleno anterior, y el nervio frénico corre sobre la superficie del músculo escaleno anterior. - Cosecha el nervio C7 derecho. Cortar el músculo escaleno anterior en el lado derecho, similar al lado izquierdo, y cortar la raíz nerviosa C7 derecha cerca del agujero intervertebral. Diseccionar el nervio C7 derecho desde su nivel de división.
NOTA: Corte con cuidado el nervio C7 derecho para evitar daños en los vasos sanguíneos debajo del nervio. - Transfiera el nervio C7 izquierdo.
- Eliminar el largo colli muscular al lado de los cuerpos vertebrales parcialmente en ambos lados. Separe y expanda sin rodeos el espacio entre la tráquea-esófago y el cuerpo vertebral.
- Envíe una sutura de nailon 5-0 de medio pliegue desde el lado derecho del cuerpo vertebral hacia el lado izquierdo a través de la ruta preespinal.
- Enganche el nervio C7 izquierdo con un tubo de infusión y guíe el nervio hacia el lado derecho a través de la vía preespinal.
- Retraiga la tráquea y el esófago suavemente y coloque las divisiones anterior y posterior del nervio C7 izquierdo con la raíz nerviosa C7 derecha sin tensión usando suturas de nailon 12-0. Sutura el epineuro alrededor de los nervios con 4-5 puntos para coaptar los nervios con fuerza.
NOTA: Es crucial elegir un tubo de infusión de plástico de grosor adecuado. Un tubo demasiado delgado podría dañar el nervio, y un tubo demasiado grueso podría dañar la tráquea y el esófago. Además, el espacio entre la tráquea-esófago y el cuerpo vertebral es un espacio en forma de "V", y cortar parte del largo colli muscular puede acortar la vía de transferencia.
4. Cierre
- de la herida Irrigar la herida con solución salina normal estéril y secarla con gasa estéril.
- Sutura el esternón y cierra la piel con suturas de monofilamento 5-0.
5. Cuidados postoperatorios
- Espere a que el ratón se despierte de la anestesia. Transfiera el ratón a una jaula limpia sin material de cama, pero calentado con una manta caliente. Observe al ratón hasta que sea ambulatorio. Utilizar tramadol (20mg/kg, i.p.) como analgesia postoperatoria.
- Coloque a los ratones en una jaula de recuperación y vigílelos hasta que se recuperen. Restaure el agua y la dieta de los ratones después de la operación. Controle a los ratones después de la operación para detectar signos de deterioro o infección todos los días, incluida la desnutrición, la postura encorvada y el pelaje erizado. A las dos semanas después de la cirugía, debe realizarse la retirada de la sutura.
NOTA: Aplique ungüento de eritromicina a la superficie de la herida todos los días durante tres días consecutivos. - Si se observan complicaciones, como edema de herida, deben resolverse de inmediato.