Construcción de una interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta en un modelo de lesión nerviosa en ratas

Abstract

Fuente: Svientek, S. R., et al. Fabricación de la interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI) en la rata adulta. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra la construcción quirúrgica de una interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI) en un modelo de rata de lesión nerviosa periférica. El procedimiento consiste en unir un nervio peroneo seccionado a un injerto muscular y superponerlo con un injerto de piel dérmica para promover la regeneración nerviosa. Con el tiempo, las neuronas motoras y sensoriales restablecen las conexiones dentro de los injertos, lo que permite la formación de estructuras neuromusculares y sensoriales funcionales.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

NOTA: Las ratas donantes pueden acceder libremente a alimentos y agua antes de los procedimientos de donación de piel y músculo. La eutanasia se realiza bajo anestesia profunda seguida de una inyección intracardíaca de cloruro de potasio con un método secundario de neumotórax bilateral. En teoría, cualquier cepa de rata se puede utilizar con este experimento; sin embargo, nuestro laboratorio ha logrado resultados consistentes en ratas Fischer F344 macho y hembra (~ 200-250 g) a los dos a cuatro meses de edad. Las ratas donantes deben ser isogénicas a las ratas experimentales.

1. Preparación del injerto dérmico

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1. Anestesiar a la rata donante en una cámara de inducción utilizando una solución de isoflurano al 5% en oxígeno a 0,8-1 L/min. Una vez anestesiada la rata, retirarla de la cámara de inducción y colocarla en un cono nasal de reinhalación, bajando el isoflurano al 2-2,5% para el mantenimiento de la anestesia.
2. Administrar una solución de 0,02-0,03 ml de carprofeno (50 mg/ml) en 0,2 ml de solución salina estéril por vía subcutánea entre los omóplatos para la analgesia.
3. Aplique ungüento de lágrimas artificiales en ambos ojos para prevenir úlceras corneales.
4. Con una maquinilla, afeite toda la parte inferior de las extremidades posteriores, la región del tobillo y los lados de las patas.
5. Limpie la extremidad posterior elegida y la superficie plantar de la pata con alcohol, seguido de una solución de yodopovidona, terminando con una limpieza final con alcohol para eliminar el yodopovidona residual.
6. Con un taladro de alta velocidad con micromotor manual con una piedra de pulido redonda de grano fino extraíble (4000 rpm), rebaje la superficie plantar de la pata para eliminar la epidermis. Mientras se rebaba, aplicar gotas de solución salina para no quemar la piel. La dermis subyacente tendrá una apariencia brillante con sangrado puntual.
7. Aplique un torniquete en la extremidad inferior para disminuir el flujo sanguíneo.
8. Retire la piel plantar bruscamente con un bisturí # 15 y colóquelo en una gasa humedecida con solución salina para evitar la desecación. Parte del tejido tendinoso y conectivo se eliminará inherentemente con la piel en este paso y se eliminará más tarde.
9. Aplique una gasa en el pie sangrante para retrasar la hemorragia. Repita los pasos 1.5-1.9 si realiza dos construcciones.
10. Bajo un microscopio (aumento de 20x), retire el tejido tendinoso y conectivo de la capa profunda del injerto de piel con unas microtijeras. Tenga cuidado de no hacer agujeros en el injerto. El injerto dérmico adelgazado debe ser ligeramente opaco y contener solo dermis, midiendo aproximadamente 0,5 cm x 1,0 cm de tamaño.
11. Coloque en una gasa humedecida con solución salina hasta que esté listo para la fabricación de construcciones C-RPNI. Los injertos deben utilizarse dentro de las 2 horas posteriores a la cosecha.

2. Preparación del injerto muscular

1. Haga una incisión longitudinal a lo largo de la cara anterior de la extremidad posterior inferior desde justo por encima del tobillo hasta justo debajo de la rodilla con un bisturí # 15. Diseccionar a través del tejido subcutáneo para exponer la musculatura subyacente.
2. En la cara distal de la incisión, exponga las inserciones tendinosas de la musculatura de las extremidades inferiores. El tibial anterior (TA) suele ser el más grande y anterior de los músculos, y justo debajo y posterior a este músculo se encuentra el extensor largo de los dedos (EDL). Aísle el tendón EDL distal de los otros tendones de la zona, teniendo cuidado de no incidir su inserción en este punto.
3. Asegure el aislamiento del tendón correcto insertando ambos dientes de una pinza debajo del tendón y ejerciendo presión hacia arriba abriendo las pinzas para provocar la excursión del tendón. La manipulación de este tendón debería hacer que todos los dedos se extiendan simultáneamente.
4. Realice una tenotomía distal con tijeras de iris afiladas y separe el músculo de los tejidos circundantes sin rodeos con tenotomias (u otras tijeras de punta roma), trabajando proximalmente para encontrar el origen tendinoso.
5. Una vez visualizado el tendón proximal, vuelva a realizar una tenotomía utilizando unas tijeras de iris afiladas. Coloque el injerto muscular en una gasa humedecida con solución salina para evitar la desecación.
6. Una vez que se hayan extraído todos los injertos deseados de una rata donante, eutanasia principalmente mediante inyección intracardíaca de KCl (1-2 mEq K + / kg) seguida de eutanasia secundaria con neumotórax de punción bilateral con una cuchilla # 15.

3. Aislamiento y preparación del nervio peroneo común

1. Anestesiar y proporcionar analgesia a la rata experimental de acuerdo con el protocolo descrito en los pasos 1.1-1.3.
2. Afeitar el muslo deseado y limpiar con alcohol, betadine y terminar con alcohol para eliminar los restos de betadine.
3. Mueva al animal de la mesa de preparación quirúrgica a la mesa del microscopio quirúrgico y colóquelo sobre una almohadilla térmica con una sonda de temperatura para mantener la temperatura corporal. Mantener el isoflurano al 2-2,5% y el oxígeno a 0,8-1 L/min.
4. Marque la incisión, que se extiende desde la parte distal hasta la muesca ciática hasta la parte inferior de la rodilla. Esta marca debe ser inferior y estar en ángulo alejado del fémur. Haga la incisión con una cuchilla # 15, haciendo una incisión a través de la fascia subyacente del bíceps femoral.
5. Diseccione cuidadosamente a través del músculo bíceps femoral con una microtijera hemostática o de punta roma hasta el espacio subyacente al bíceps femoral.
   NOTA: El nervio ciático viaja aproximadamente en la misma dirección que la incisión inicial que se realizó. Hay tres ramas, típicamente con el nervio sural posterior y el nervio peroneo común y tibial que viajan superficial y profundamente hasta la rodilla, respectivamente.
6. Después de la identificación del nervio peroneo común (CP), utilizando un par de micropinzas de punta fina y microtijeras, aísle cuidadosamente el nervio CP de las otras ramas ciáticas y elimine distalmente cualquier tejido conectivo persistente.
7. En el punto donde el nervio cruza la superficie de la rodilla, corte bruscamente el nervio con un par de microtijeras.
   NOTA: El uso de tijeras afiladas es extremadamente importante en este paso, ya que causar un trauma significativo en el nervio podría aumentar el riesgo de formación de neuromas.
8. Libere con cuidado cualquier tejido conectivo restante del nervio CP y trabaje proximalmente para liberar el nervio a una longitud de aproximadamente 2 cm.

4. Fabricación de construcciones C-RPNI

1. Retire el injerto muscular de una gasa humedecida con solución salina y elimine todo el tejido tendinoso central, así como un pequeño segmento central de epimisio. Deje intactos los extremos tendinosos.
2. Usando una ventaja de 8-0 sutura de nylon, asegure el epineuro del extremo seccionado del nervio CP al área del injerto muscular desprovisto de epimisio con dos puntos interrumpidos a cada lado del nervio.
3. Asegure el injerto muscular al periostio del fémur con una sola puntada interrumpida de nailon 6-0 tanto proximal como distalmente, con la unión nervio-músculo en dirección opuesta al fémur.
   NOTA: Asegure el músculo para que tenga una longitud normal y relajada. Trate de no estirar el músculo significativamente o dejar demasiada laxitud al asegurarlo.
4. Coloque un 8-0 punto de nailon en el margen inferior central del epimisio del injerto muscular, asegurándolo al epineuro del nervio CP de manera que cree laxitud en el nervio dentro del injerto muscular y ayude a aliviar cualquier tensión futura a la que pueda estar expuesto con la deambulación posterior.
5. Retire el injerto de piel de la gasa humedecida con solución salina y colóquelo sobre el injerto muscular de tal manera que cubra completamente el nervio y la mayor parte del músculo. Asegúrese de que el margen profundo de la dermis descanse sobre el músculo. Recorta cualquier dermis que se extienda más allá del borde del músculo.
6. Asegure el injerto de piel al injerto muscular circunferencialmente usando 8-0 suturas interrumpidas de nylon. Por lo general, se utilizan de 4 a 8 suturas en total según el tamaño de la construcción.
7. Cierre la fascia del bíceps femoral sobre la construcción de manera continua con sutura crómica 5-0.
8. Cierre la piel suprayacente con una sutura crómica 4-0 en forma de carrera.
9. Limpie el área quirúrgica con una almohadilla con alcohol y aplique ungüento antibiótico.
10. Deje de tomar anestesia inhalatoria y permita que la rata se recupere con fuentes de comida y agua separadas de sus compañeros de jaula.

Materials