Aislamiento fotodegradable basado en hidrogel de colonias bacterianas en matrices de micropocillos

Resumen

Fuente: Fattahi, N., et al. Interfaces de hidrogel fotodegradables para la detección, selección y aislamiento de bacterias. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el uso de hidrogeles fotodegradables para aislar colonias bacterianas dentro de matrices de micropocillos de silicio. Las células bacterianas se cargan primero en micropocillos, se encapsulan en un hidrogel reticulado y se cultivan en colonias distintas. Tras la exposición a la luz ultravioleta, la degradación selectiva del hidrogel permite la extracción selectiva de colonias individuales.

Protocolo

1. Cepas bacterianas y protocolos

1. de cultivo Colonias de bacterias en placas de agar complementadas con medios de crecimiento apropiados. En este reporte, Bacillus subtilis (cepa 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) se cultiva en ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO 4,7H₂O, 0,06 mM CaCl _{2,2H 2}O, 0,0071 mM MnSO₄·H₂O, 0,125 M FeSO_{4,7H 2}O, Placas de agar de 28 mM de glucosa, pH: 7 ± 0,2, agar 15 g/L) suplementadas con 100 μg/mL de espectinomicina y Escherichia coli (cepa 25922, ATCC) en placas de agar ATGN suplementadas con 100 μg/mL de ampicilina.
   NOTA: En los informes anteriores de encapsulación y liberación de hidrogel con estos materiales se utilizaron células C58 de A. tumefaciens Recoger
2. las colonias deseadas de las placas de agar ATGN y comenzar los cultivos durante la noche. Para las cepas de E. coli y B. subtilis utilizadas aquí, cultivar a 37 °C agitando a 215 rpm en medio líquido ATGN durante 24 h. Almacene los cultivos celulares en glicerol al 50% a -80 °C hasta su uso futuro.
3. Recoger colonias de ambas cepas de las reservas de glicerol utilizando asas de inoculación estériles e incubar en medios líquidos ATGN durante 24 h a 37 °C y 215 rpm.

2. Preparación del material necesario para la formación de hidrogel

1. Síntesis de diacrilato de poli(etilenglicol)o-nitrobencilo (diacrilato PEG-o-NB)
   NOTA: La síntesis interna del diacrilato de PEG-o-NB ha sido bien descrita y reportada anteriormente. Alternativamente, debido a que la síntesis es rutinaria, se puede subcontratar desde una instalación de síntesis química.
2. Tampón de reticulación
   1. Tome la receta del medio seleccionado para la cepa bacteriana y prepare el medio con 2x nutrientes. Añadir fosfato, por ejemplo, NaH₂PO_4, al medio hasta una concentración final de 100 mM. A continuación, ajuste el valor de pH a 8 utilizando 5 M de NaOH (aq).
   2. Esterilice la solución tampón y guárdela a -20 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: Omita los metales de transición presentes en el medio, ya que estos metales catalizan la oxidación de los tioles a disulfuros.
3. solución de diacrilato de PEG-o-NB
   1. Por cada mg de polvo de alícuota de diacrilato de PEG-o-NB (peso molecular de 3.400 Da), añadir 3,08 μl de agua ultrapura para alcanzar una concentración de 49 mM de diacrilato de PEG-o-NB (concentración de acrilato de 98 mM).
   2. Agite la solución hasta que esté bien mezclada y guárdela a -20 °C hasta su uso posterior.
4. Solución de PEG-tiol de 4 brazos
   1. Para la preparación de PEG-tiol de 4 brazos (peso molecular de 10.000 Da), agregue 4 μL de agua ultrapura por mg de polvo para alcanzar una concentración de 20 mM (80 mM de concentración de tiol).
   2. Agite esta solución hasta que esté bien mezclada y guárdela a -20 °C hasta su uso posterior.

5. Fabricación de matrices de micropocillos de silicio Recubrimiento de

1. parileno: Utilice el protocolo estándar descrito en artículos de investigación anteriores para recubrir obleas de silicio con parileno.
2. Microfabricación: Siga el protocolo descrito en la literatura para diseñar y fabricar la matriz de micropocillos (Figura 1).
   NOTA: Se aplicaron técnicas fotolitográficas estándar para fabricar matrices de micropocillos en obleas de silicio recubiertas de parileno.

7. Formación de hidrogel sobre matrices de micropocillos

1. Siembra de bacterias en matrices de micropocillos
   NOTA: Se sembraron 700 μL de suspensiones celulares de 0,1 OD₆₀₀ (densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm) sobre los sustratos de la matriz de micropocillos y se aplicó el método de despegue de parileno para eliminar las células del fondo.
2. Prepare la solución precursora de hidrogel añadiendo 5,6 μl de diacrilato PEG-o-NB con 12,5 μl de solución salina tamponada con fosfato de pH 8 ATGN y mezclando con 6,9 μl de la solución de tiol PEG de cuatro brazos.
3. Pipetee 12,5 μl de la solución precursora en un portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado no reactivo y coloque dos espaciadores de acero de 38 μm (consulte la tabla de materiales) en dos lados opuestos del sustrato de la matriz de micropocillos inoculado con células.
4. Invierta el portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado con la gota de solución precursora y coloque la gota en el medio del sustrato del micropocillo. Luego, incube durante 25 minutos a temperatura ambiente (RT) para la formación de hidrogel.
5. Retire suavemente el portaobjetos de vidrio del sustrato del micropocillo. La membrana de hidrogel debe permanecer unida al sustrato del micropocillo.

Resultados

Figura 1: Diseño y fabricación de matrices de micropocillos. (A) Se aplicaron técnicas de microfabricación estándar para fabricar matrices de micropocillos en obleas de silicio. (B) Cada sustrato consistía e...

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