Separación de las fracciones de membrana interna y externa de bacterias gramnegativas

Resumen

Fuente: Cian, M. B. et. al., Separación de la envoltura celular de bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la separación de las fracciones de membrana interna y externa de bacterias gramnegativas mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Las fracciones de membrana se purifican y almacenan a bajas temperaturas para el análisis específico de componentes específicos de la membrana.

Protocolo

1. Preparación general de reactivos y medios para la extracción de membranas

1. Medios de crecimiento bacteriano: Prepare y esterilice 1 L de medio de caldo en un matraz de 2 L completamente limpio y esterilizado en autoclave.
2. Tampón de resuspensión general (tampón de tris(hidroximetil)aminometano de 1 M (tampón de Tris) pH 7,5; 50 ml): Disuelva 6,05 g de base de Tris en 30 ml de H₂O. Ajuste el pH a 7,5 con HCl 5 M. Ajuste el volumen final a 50 ml con H₂O ultrapuro.
3. Stock maestro de solución de quelación catiónica divalente (ácido etilendiaminotetraacético 0,5 M, EDTA pH 8; 100 mL): Añadir 18,6 g de tetraacetato de etileno disódico·2H₂O a 80 mL de H₂O. Remover vigorosamente y ajustar el pH a 8,0 con hidróxido de sodio (NaOH). Ajuste el volumen final a 100 ml con H₂O.
   NOTA: La sal disódica del EDTA no se disolverá hasta que el pH de la solución se ajuste a ~8,0 mediante la adición de NaOH.
4. Tampón osmótico A (sacarosa 0,5 M, Tris pH 7,5 mM 10 m; 1 L): Pesar 171,15 g de sacarosa y transferirla a un cilindro de 1 L. Añadir 10 ml de 1 M Tris pH 7,5. Ajustar a un volumen final de 1 L con ultrapuro H₂O. Almacenar a 4 °C.
5. Lisozima (10 mg/ml; 5 ml): pesar 50 mg de lisozima (clara de huevo de gallina) y disolver en 5 ml de H₂O ultrapuros. Almacenar a 4 °C.
6. Solución de quelación catiónica divalente diluida (1,5 mM de EDTA; 500 mL): Añadir 1,5 mL de 0,5 M EDTA (Paso 1.3) a 497,5 mL de H₂O. Almacenar a 4 °C.
7. Tampón osmótico B (sacarosa 0,2 M, Tris pH 7,5 mM 10 m; 2 L): Pesar 136,8 g de sacarosa y transferirla a un cilindro de 2 L. Añadir 20 ml de 1 M Tris pH 7,5. Ajuste el volumen final a 2 L con ultrapure H₂O. Almacenar a 4 °C.
8. Cofactor de nucleasa (cloruro de magnesio 1 M, MgCl₂; 10 mL): Disolver 2,03 g de MgCl₂·6H₂O en 8 mL de H₂O ultrapuro. Ajustar el volumen a 10 mL. Almacenar a temperatura ambiente.
9. Cóctel de solución de nucleasa que incluye enzimas ARNasa y ADNasa: consulte la tabla de materiales. Almacenar a -20 °C.
10. Cóctel de inhibidores de la proteasa: Ver tabla de materiales. Conservar a 4 °C.
11. Solución de gradiente de sacarosa isopícnica de baja densidad (sacarosa al 20% p/v, EDTA 1 mM, solución Tris pH 7,5 mM; 100 ml): Pesar 20 g de sacarosa y transferir a un cilindro de 200 ml. Agregue 100 μL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 μL de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 ml con H₂O ultrapuro. Almacenar a temperatura ambiente.
12. Solución de gradiente de sacarosa isopícnica de densidad media (sacarosa al 53% p/v, EDTA 1 mM, solución Tris pH 7,5 1 mM; 100 mL): Pesar 53 g de sacarosa y transferir a un cilindro graduado de 200 mL. Agregue 100 μL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 μL de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 mL con H₂O ultrapuro. Almacenar a temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare esta solución en un cilindro graduado para garantizar la precisión debido al alto porcentaje de sacarosa. Agregue una barra de agitación magnética y revuelva hasta que la sacarosa se disuelva por completo en la solución. Este proceso puede tardar varias horas.
13. Solución de gradiente de sacarosa isopícnica de alta densidad (73% p/v de sacarosa, 1 mM de EDTA, 1 mM de solución Tris pH 7.5; 100 mL): Pese 73 g de sacarosa y transfiérala a un cilindro graduado de 200 mL. Agregue 100 μL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 μL de 0.5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 ml con H₂O ultrapuro. Almacenar a temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare esta solución en un cilindro graduado para garantizar la precisión debido al alto porcentaje de sacarosa. Agregue una barra de agitación magnética y revuelva hasta que la sacarosa se disuelva por completo. Este proceso puede tardar varias horas.
14. Tampón de almacenamiento de membrana aislada (tampón Tris de 10 mM pH 7,5; 1 L): Agregue 1 ml de tampón Tris de 1 M pH 7,5 a un matraz de 1 L y ajuste el volumen final a 1 L con H₂O ultrapuro.

2. Preparación de bacterias para la extracción de membranas

1. Raye las bacterias de las existencias de glicerol congeladas en placas de agar frescas. Almacenar las placas a 4 °C una vez que se desarrollen las colonias. Inocular una sola colonia en un tubo de 5 ml lleno de caldo y cultivar las bacterias como desee durante la noche.
2. Diluya el cultivo bacteriano durante la noche en 1 L de medio de caldo preferido y cultive las bacterias hasta lograr la densidad óptica deseada.
   NOTA: Se recomienda inocular una sola colonia bacteriana en 1 L de medio de caldo para genotipos mutantes que son propensos a suprimir los fenotipos de crecimiento, pero algunas bacterias Gram-negativas simplemente crecen más lentamente que otras. Si no es posible lograr una densidad de cultivo suficiente mediante la inoculación de una sola colonia, la retrodilución de un cultivo nocturno en 1 L de medio es una estrategia para sincronizar el crecimiento. La composición de la membrana bacteriana varía según la fase de crecimiento del cultivo (fase logarítmica frente a fase estacionaria). Las curvas de crecimiento que miden el cambio en la densidad óptica de los cultivos bacterianos en función del tiempo deben realizarse con todas las cepas para correlacionar la densidad del cultivo con la fase de crecimiento.
3. Coloque los frascos que contienen los cultivos de caldo en hielo. Lea la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) y calcule el volumen de cultivo que equivale a entre 6,0 y 8,0 x 10¹¹ unidades formadoras de colonias bacterianas (UFC). Para S. Typhimurium, esto corresponde a 1 L de cultivo a un OD₆₀₀ de entre 0,6 y 0,8, ya que un OD600 de 1,0 es igual a aproximadamente 1,0x10⁹ UFC/ml. Agregue este volumen a un tubo de centrífuga y asegúrese de que los cultivos restantes permanezcan en hielo hasta que se vayan a usar.
4. Peletizar las bacterias por centrifugación a 4 °C a 7.000-10.000 x g en una centrífuga de ángulo fijo de alta velocidad durante 10 min.
   NOTA: Preenfriar y mantener las centrífugas a baja temperatura. Mantenga las muestras en hielo durante todo el procedimiento.
5. Decantar y desechar el sobrenadante con cuidado.
   NOTA: Si las fracciones de membrana no se van a extraer inmediatamente, el pellet puede congelarse rápidamente y/o almacenarse a -80 °C. Sin embargo, se recomienda proceder directamente con la plasmólisis el mismo día en que se recolectan las células, especialmente para especies no enterobacterianas.

3. Disociación de la membrana externa y plasmólisis

1. Descongele los gránulos celulares en hielo si se almacenaron previamente a -80 ° C, y retenga las muestras en hielo durante el resto del procedimiento. Vuelva a suspender cada sedimento celular dentro del tubo de centrífuga en 12,5 ml de tampón A. Agregue una barra de agitación magnética a la suspensión de las células.
2. Agregue 180 μL de lisozima de 10 mg / ml (concentración final de 144 μg / ml) a cada resuspensión celular. Mantenga las muestras en hielo mientras revuelve durante 2 min.
3. Agregue 12,5 ml de solución de EDTA 1,5 mM a cada resuspensión celular y continúe revolviendo en hielo durante 7 minutos más.
4. Decantar la suspensión en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 9.000-11.000 x g durante 10 min a 4 °C.
5. Deseche los sobrenadantes en un contenedor de desechos de riesgo biológico y retenga los gránulos en hielo.
6. Agregue 25 ml de tampón B al sedimento celular.
7. Agregue 55 μL de 1 M MgCl₂, 1 μL de reactivo de ARNasa/DNasa nucleasa (para evitar problemas de viscosidad asociados con bacterias sometidas a plasmólisis antes de la homogeneización) y 1 μL de cóctel inhibidor de proteasa al volumen del tampón B que se encuentra encima del gránulo celular Vuelva a
8. suspender el gránulo en la mezcla de tampón B. Pipetear vigorosamente y agitar hasta observar una solución homogénea.
   NOTA: Es muy importante tener una solución homogénea antes de continuar con el Paso 4 de este protocolo. Las celdas resuspendidas deben tener una apariencia y consistencia viscosas, similares a las de la masa de un pastel.
9. Agite cada muestra durante 15 s. Mantenga las suspensiones en hielo y continúe con el Paso 4.

4. Homogeneización presurizada y lisis
NOTA: Se pueden utilizar varios métodos para la lisis. La sonicación no es ideal debido a la generación de calor. La lisis osmótica se puede lograr, pero a menudo es ineficiente. Por lo tanto, recomendamos la lisis a alta presión. La lisis a alta presión se puede lograr utilizando una variedad de instrumentos. Sugerimos máquinas de homogeneización, como la prensa francesa o la Emusliflex. Trabajamos con muchos tipos de bacterias Gram-negativas cuya respuesta a las soluciones de sacarosa de alta osmolar varía. El paso de homogeneización a alta presión mejora la eficiencia, la reproducibilidad y el rendimiento.

1. Preenfríe la celda de prensa francesa a 4 °C o inserte la bobina de metal de la máquina homogeneizadora en hielo.
2. Vierta la muestra en la celda de presión francesa o en el cilindro de muestra del homogeneizador y coloque la celda bajo la presión de homogeneización deseada (10,000 psi debería ser adecuado cuando se usa una prensa francesa o 20,000 psi cuando se usa un homogeneizador).
3. Ajuste el caudal de salida a aproximadamente una gota por segundo mientras mantiene la presión si utiliza una prensa francesa.
4. Recoja el lisado celular en tubos cónicos de 50 ml mientras mantiene las muestras en hielo.
5. Repita los pasos 4.2-4.4 de tres a cinco veces para lograr una lisis completa, que generalmente se indica por un aumento gradual en la transparencia de la muestra.
   NOTA: La cámara de muestras debe lavarse y equilibrarse con tampón B entre muestras.
6. Mantenga las células lisadas en hielo.

5. Fraccionamiento total por membrana

1. Centrifugar las muestras bacterianas lisadas a 6.169 x g durante 10 min a 4 °C para granular el material celular intacto restante. (por ejemplo, células bacterianas no lisadas).
2. Distribuya la porción restante del sobrenadante, que ahora contiene las membranas homogeneizadas, en una botella de policarbonato para ultracentrifugación.
   PRECAUCIÓN: Si es necesario, las muestras celulares se pueden equilibrar diluyendo con tampón B.
3. Ultracentrifugar los lisados celulares a 184.500 x g durante al menos 1 h, a 4 °C. Este paso se puede realizar durante la noche sin afectar la calidad de las membranas.
4. Deseche el sobrenadante restante presente en el tubo de ultracentrífuga y retenga los gránulos de membrana en hielo (Figura 1).
5. Vuelva a suspender los gránulos de membrana en 1 ml de la solución de gradiente de sacarosa isopícnica de baja densidad utilizando un homogeneizador de vidrio-Dounce. Transfiera el homogeneizado de muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con una pipeta Pasteur de vidrio y retírelo en hielo.
   NOTA: Si solo se desea un análisis de la composición total de la membrana, sustituya 1 ml de solución de gradiente de sacarosa isopícnica de baja densidad por 1 ml de tampón de almacenamiento de membrana aislado. El paso 5.5 es el punto final del aislamiento si solo se desean muestras totales de membrana bacteriana. Almacene las muestras a -20 °C hasta que se requiera un análisis posterior adicional.

6. Ultracentrifugación por gradiente de densidad para separar las membranas dobles

1. Reúna la cantidad adecuada de tubos abiertos de polipropileno de 13 ml o ultratransparentes especificados para un rotor de cubeta oscilante y una ultracentrífuga.
2. Sostenga el tubo en una posición ligeramente inclinada y prepare el gradiente de sacarosa agregando lentamente soluciones de sacarosa de mayor densidad a menor densidad en el siguiente orden: 2 ml de sacarosa al 73% p/v,1 mM de EDTA, 1 mM de Tris pH 7,54 ml de 53% p/v de sacarosa, 1 mM de EDTA, 1 mM de Tris pH 7,5
   1. Siguiente, agregue la fracción de membrana total (1 ml), que se ha resuspendido en la solución de sacarosa al 20% p/v (paso 5.5). Evite mezclar la fracción de membrana con la solución de sacarosa que se encuentra debajo. Las divisiones deben ser visibles entre cada una de estas capas.
   2. Finalmente, llene el tubo con la solución de gradiente de sacarosa isopícnica de baja densidad (aprox. 6 ml). El polipropileno y los tubos abiertos ultratransparentes deben llenarse lo más posible (a 2 o 3 mm de la parte superior del tubo) para el soporte del tubo.
3. Ajuste para Acinetobacter baumannii 17978
   1. Adaptar un gradiente de sacarosa ajustado para su uso con diferentes muestras bacterianas. Para A. baumannii, el siguiente gradiente de sacarosa permitió una separación más completa de las membranas (Figura 2).2 mL de sacarosa al 73% p/v, 1 mM de EDTA, 1 mM de Tris pH 7,54 mL de sacarosa al 45% p/v, 1 mM de EDTA, 1 mM de Tris pH 7,5
   2. A continuación, agregue la fracción total de la membrana (1 mL), que se ha resuspendido en la solución de sacarosa al 20% p/v (paso 5.5). Evite mezclar la fracción de membrana con la solución de sacarosa que se encuentra debajo. Las divisiones deben ser visibles entre cada una de estas capas.
   3. Finalmente, llene el tubo con una solución de gradiente de sacarosa isopícnica de baja densidad (aprox. 6 ml). El polipropileno y los tubos abiertos ultratransparentes deben llenarse lo más posible (a 2 o 3 mm de la parte superior del tubo) para el soporte del tubo.
4. Ultracentrifugar las muestras utilizando un rotor de cubo oscilante a 288.000 x g y 4 °C durante la noche.
   NOTA: Para los volúmenes utilizados en los pasos anteriores, recomendamos tiempos de centrifugación entre 16 h y 23 h.
5. Corta el extremo de la punta de una pipeta P1000 a unos 5 mm de la punta. Con la pipeta, retire la capa superior de membrana interna (IM) marrón. Transfiera la fracción IM a una botella de policarbonato para ultracentrifugación.
6. Deje aproximadamente 2 ml de la solución de sacarosa por encima de la interfaz 53-73% para asegurarse de que la membrana externa blanca inferior (MO) no se contamine de forma cruzada con la fracción IM. Repita el procedimiento de pipeteo del paso 6.4 para la fracción MO (Figura 1).
   NOTA: Las membranas también se pueden recoger perforando los tubos de centrífuga en la parte inferior con una aguja y recogiéndolos como fracciones gota a gota.
7. Llene el vacío restante del tubo de ultracentrífuga con tampón de almacenamiento de membrana aislada y mezcle mediante inversión o pipeteo. Conserve las muestras en hielo.
8. Recoger las membranas ahora lavadas y aisladas por ultracentrifugación a 184.500 x g durante 1 h a 4 °C.
9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las membranas mediante la homogeneización Dounce. Agregue 500-1000 μL de tampón de almacenamiento. Recoger muestras en tubos de microcentrífuga de 2 ml.
10. Almacenar las muestras de membrana bacteriana a -20 °C.

Resultados

Figura 1: Un esquema que representa el procedimiento de aislamiento de membrana bacteriana Gram-negativa descrito en este artículo de métodos. Se muestra el procedimiento utilizado para recolectar células bacterianas y aislar las membranas total, interna ...

Materiales