1. Recolección de muestras para extracción de polifosfato
- Cultive bacterias en las condiciones de interés para determinar el contenido de poliP. Para este protocolo, cultivar Lactobacillus reuteri durante la noche a 37 °C sin agitar en medio de inducción de enzimas málicas (MEI) sin cisteína (MEI-C).
- Coseche suficientes células por centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para un total de 50 a 100 μg de proteína celular (consulte el paso 3 a continuación). Para E. coli, esto es 1 ml de un cultivo en fase logarítmica a un A600 de 0,2 a 0,4. Para L. reuteri, esto es 1 ml de un cultivo nocturno. Ajuste según sea necesario para otras especies de interés.
- Retire completamente el sobrenadante de los gránulos celulares.
- Vuelva a suspender los gránulos celulares en 250 μL de tampón de lisis GITC (isotiocianato de guanidina 4 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7) y lisar por incubación a 95 °C durante 10 min. Almacenar lisados a -80 °C.
NOTA: Sea coherente con el tiempo de lisis, ya que la incubación prolongada a alta temperatura puede provocar la degradación de poliP por hidrólisis. Los lisados se pueden almacenar indefinidamente a -80 °C.
PRECAUCIÓN: El isotiocianato de guanidina es una sal caotrópica y debe manipularse con guantes y eliminarse como residuo peligroso.
2. Medición del contenido de proteínas de los lisados celulares
- Prepare patrones de albúmina sérica bovina (BSA) que contengan 0, 0,1, 0,2 y 0,4 mg mL-1 de BSA en tampón de lisis GITC.
NOTA: Es importante hacer los estándares BSA en GITC, ya que GITC influye en el desarrollo del color del ensayo Bradford. Los estándares BSA se pueden almacenar indefinidamente a -20 °C. - Alícuota 5 μL de lisados celulares descongelados y bien mezclados y de patrones BSA para separar los pocillos en una placa transparente de 96 pocillos.
- Agregue 195 μL de reactivo Bradford a cada pocillo y mida la absorbancia a 595 nm (A595) en un lector de placas (consulte la Tabla de materiales).
- Calcule la cantidad de proteína en cada pocillo en comparación con la curva estándar de BSA, usando la fórmula y = mx + b, donde y es A595, x es μg de BSA, m es la pendiente de la curva estándar y b es la intersección con y de la curva estándar. Multiplique el valor resultante por 0,05 para determinar el total de mg de proteína en cada muestra.
3. Extracción de polifosfato
- Agregue 250 μL de etanol al 95% a cada muestra lisada por GITC y vórtice para mezclar.
- Aplique esa mezcla a una columna de centrifugación de membrana de sílice y centrifugue durante 30 s a 16,100 x g.
- Deseche el flujo continuo, luego agregue 750 μL de Tris-HCl 5 mM (pH 7.5), 50 mM de NaCl, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), etanol al 50% y centrifugue durante 30 s a 16,100 x g.
- Deseche el flujo continuo y centrifugue durante 2 min a 16.100 x g.
- Coloque la columna en un tubo de microfuga limpio de 1,5 ml y agregue 150 μl de Tris-HCl 50 mM (pH 8).
- Incubar a temperatura ambiente durante 5 min, luego eluir polyP centrifugando durante 2 min a 8.000 x g.
NOTA: Si se desea, los eluidos se pueden almacenar a -20 °C durante al menos 1 semana.
4. Digestión del polifosfato
- Prepare patrones que contengan 0, 5, 50 o 200 μM de fosfato de potasio en 50 mM de Tris-HCl (pH 8).
NOTA: Los estándares de fosfato de potasio se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente. - Alícuota de 100 μl de cada patrón de fosfato y de muestras de poliP extraídas en pocillos separados de una placa transparente de 96 pocillos.
- Prepare una mezcla maestra que contenga (por muestra): 30 μL de tampón de reacción 5x ScPPX (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM acetato de amonio, pH 7,5)13, 19 μL de H2O y 1 μL de ScPPX purificado (1 mg mL-1).
- Agregue 50 μL de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar durante 15 min a 37 °C.
NOTA: Si se desea, las muestras de poliP digeridas se pueden almacenar a -20 °C indefinidamente.
5. Detección de fosfato libre
- Prepare la base de la solución de detección disolviendo 0,185 g de tartrato de potasio y antimonio en 200 ml de agua, agregando 150 ml de 4 N H2SO4, luego agregando 1,49 g de heptamolibdato de amonio. Revuelva para disolver y luego lleve a un volumen final de 456 ml. Filtrar la solución para eliminar las partículas y conservar protegida de la luz a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
- Prepare una solución madre de ácido ascórbico 1 M. Almacenar protegido de la luz a 4 °C hasta por 1 mes.
- Prepare un nuevo material de trabajo de solución de detección cada día mezclando 9,12 ml de base de solución de detección con 0,88 ml de ácido ascórbico 1 M. Deje que la solución de detección alcance la temperatura ambiente antes de su uso.
- Agregue 50 μl de solución de detección a cada muestra y estándar en la placa de 96 pocillos e incube a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos para permitir el desarrollo del color.
- Mida la absorbancia a 882 nm con un lector de placas y calcule la concentración de fosfato de cada muestra en comparación con la curva estándar de fosfato de potasio.
PRECAUCIÓN: La solución de detección contiene sales tóxicas y ácidos fuertes. Use guantes y trate el exceso de solución como desechos tóxicos.
6. Cálculo del contenido de polifosfato celular
- Convierta las concentraciones de fosfato determinadas en el paso 5.5 en nanomoles de fosfato derivado de poliP en cada lisado celular completo de acuerdo con la siguiente fórmula:
nmol polyP = 1,5 x (μM fosfato / 10)
NOTA: El método estándar basado en curvas en el paso 5 determina la concentración de fosfato (en μM) en cada muestra de poliP de 100 μL alícuota en el paso 4.2. Para convertir esta concentración en un número de nmol, 100 μL se divide por 106 para obtener un volumen en L, multiplicado por la concentración (μmol L-1), luego multiplicado por 1,000 (el número de nmol en un μmol). Esto se reduce a dividir la concentración por 10. El volumen total de extracto preparado en el paso 3 es de 150 μL, por lo que es necesario multiplicar el valor resultante por 1,5 para calcular el nmol de fosfato presente en todo el extracto. - Normalice el contenido de poliP celular a proteína celular total dividiendo nmol poliP por el mg de proteína total en cada muestra determinada en el paso 1.4. Los niveles de poliP se expresan en términos de la concentración de fosfato libre derivado de poliP individual.
NOTA: En algunos casos, la cantidad de fosfato derivado de poliP presente en una muestra puede quedar fuera del rango lineal de la curva estándar de fosfato. Si los niveles de poliP son muy altos, el exceso de eluido que contiene poliP del paso 3.6 se puede diluir 1:10 o 1:100, según sea necesario, y luego medirse nuevamente como se describe en los pasos 4 a 6.
