Ensayo de replicación de Legionella pneumophila en macrófagos pretratados con vesículas de membrana externa

Resumen

Fuente: Jung, A. L. et. al., Vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila: aislamiento y análisis de su potencial proinflamatorio en macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el pretratamiento de macrófagos con vesículas de membrana externa (OMV) de Legionella pneumophila para examinar su efecto sobre la replicación bacteriana. Al alterar la señalización inmune del huésped, los OMV hacen que los macrófagos sean más permisivos a la infección. Los recuentos de colonias más altos en las células tratadas, en comparación con las no tratadas, indican que las OMV promueven la replicación de L. pneumophila dentro de los macrófagos.

Protocolo

1. Pre-tratar macrófagos

1. Prepare células THP-1 (células Tohoku Hospital Pediatrics-1, una línea celular de leucemia monocítica humana).
   NOTA: THP-1 es una línea celular monocítica derivada de un paciente con leucemia.
   1. Agregue 2x10 5 células THP-1 por 24 pocillos y diferéncielas agregando 20 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) en células similares a macrófagos. Incubar durante 24 h a 37 °C.
   2. Reemplace el medio con 500 μL de medio fresco e incube durante otras 24 h; el medio óptimo para las células THP-1 comprende Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 de glucosa alta suplementada con suero fetal de ternera al 10%.
2. Aislar los macrófagos derivados de la médula ósea murina (mBMDM).
3. Tratar macrófagos derivados de THP-1 o mBMDM con vesículas de membrana externa (OMV).
   1. Descongele los OMV y agréguelos a los macrófagos humanos o murinos de acuerdo con su cantidad de proteína (0.1, 1 y 10 μg / mL). Incubar los macrófagos con OMV a 37 °C durante al menos 20 h.

2. Infectar los macrófagos y evaluar la replicación bacteriana con un ensayo de unidad formadora de colonias (UFC)

1. Utilice Legionella pneumophila, células THP-1 pretratadas o mBMDM del paso 4.3, y no macrófagos pretratados como controles (2x10⁵/24 pocillos). No cambie el medio.
2. Infectar células THP-1 con L. pneumophila Corby WT y mBMDM con un mutante carente de flagelina de L. pneumophila Corby (ambos con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5; 1x10⁵ L. pneumophila/24 pocillos) e incubar durante 24 y 48 h, respectivamente.
3. Lisar las células en su medio mediante la adición de saponina (concentración final: 0,1%) e incubar a 37 °C durante 5 min.
4. Vuelva a suspender las bacterias mediante pipeteo y transfiera la suspensión a un recipiente de reacción. Preparar diluciones en serie de los medios que contienen L. pneumophila en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
5. Estropee 50 μL de las diluciones requeridas en placas de agar de extracto de levadura de carbón tamponado (BCYE) e incube durante 3 días a 37 °C.
6. Cuente visualmente las colonias formadas. Calcule la CFU

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Normalice el resultado del recuento de UFC a macrófagos no pretratados sino infectados, que se establecen al 100%.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 cm Petridish	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	82.1473
Carbón activado	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	5210.2
Agar Columbia con 5 % de sangre de oveja	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemania)	254005
Nitrato férrico no hidratado	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	5632.1
Suero fetal de ternero (FCS)	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemania)	10270-106
Heracell 240i Incubadora de dióxido de carbono	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	75004515
Asa de inoculación	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	Amablemente proporcionado por la Prof. Dra. Antje Flieger (RKI, Berlín, Alemania)
L. pneumophila Corby ΔflaA	---	---	Amablemente proporcionado por el Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlín, Alemania)
mBMDM	---	---	Amablemente proporcionado por el Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Alemania) y el Prof. Dr. Carsten Kirschning (Universidad de Duisburg Essen, Essen, Alemania)
PBS	Biochrom GmbH (Berlín, Alemania)	L 1825
Phorbol 12-miristato 13-acetato	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemania)	P8139-1MG
Agitador giratorio (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	SHKE6000
RPMI 1640 glucosa alta	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemania)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Inglaterra)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemania)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)
Extracto de levadura	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	2363.2