Un procedimiento para la recolección bacteriana y la lisis mecánica

Resumen

Fuente: Mercier, N., et al. Purificación de afinidad MS2 junto con secuenciación de ARN en bacterias grampositivas. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra un procedimiento paso a paso para recolectar células bacterianas y lisarlas mecánicamente para liberar contenido intracelular.

Protocolo

1. Recolección de bacterias

PRECAUCIÓN: Este paso implica el manejo de bacterias patógenas.

1. Cultive una colonia de cepas que transporten plásmidos pCN51-P3-MS2-sRNA o pCN51-P3-MS2 en 3 ml de medio de infusión cerebral y cardíaca (BHI) suplementado con eritromicina (10 μg / μL) en duplicados.
2. Diluir cada cultivo nocturno en 50 ml (≈1/100) de medio BHI fresco suplementado con eritromicina (10 μg/μl) para alcanzar un DO_{de 600 nm} de 0,05. Utilice matraces esterilizados de 250 ml (proporción 5:1 matraz-medio).
   NOTA: Las condiciones de medio y crecimiento deben establecerse de acuerdo con el patrón de expresión del ARNs estudiado.
3. Cultive cultivos a 37 ° C con agitación a 180 rpm durante 6 h.
4. Transfiera cada cultivo a un tubo de centrífuga de 50 ml.
5. Centrifugar a 2.900 x g durante 15 min a 4°C. Desechar el sobrenadante.
6. Mantenga los gránulos en hielo y realice directamente la lisis celular mecánica o congele y almacene los gránulos a -80 °C.

2. Lisis celular mecánica

PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos deben realizarse en hielo y los tampones deben estar a 4 °C. Use guantes y tome todas las precauciones para proteger las muestras de las ARNasas.

1. Vuelva a suspender los gránulos (paso 1.6) en 5 ml de tampón A (150 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl pH 8, 1 mM de MgCl₂ y 1 mM de DTT).
2. Transfiera las celdas resuspendidas en tubos de centrífuga de 15 ml con 3,5 g de perlas de sílice (0,1 mm).
3. Inserte tubos en un instrumento mecánico de lisis celular. Ejecute un ciclo de 40 s a 4,0 m/s.
   NOTA: Si un ciclo no es suficiente para romper las células, deje que el dispositivo se enfríe durante 5 minutos mientras mantiene las muestras en hielo. Luego, repita otro ciclo de 40 s a 4.0 m / s. La eficiencia de la lisis celular se puede probar sembrando el sobrenadante en una placa de agar BHI.
4. Centrifugar a 15.700 x g durante 15 min. Recuperar el sobrenadante y mantenerlo en hielo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
15 mL tubos de centrífuga	Falcon	352070
Tubos de centrífuga de 50 mL Falcon		352051
matraz de cultivo de 250 mL	Dominique Dutscher	2515074	Cultivos
BHI (Infusión de cerebro y corazón) Caldo	Sigma-Aldrich	53286	Medio de crecimiento
Eritromicina (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Medio de crecimiento
Matriz de lisis B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Lisis mecánica
Solución RNAPro MP	Biomedicals	6055050	Lisis mecánica
Dispositivo FastPrep	MP Biomedicals	116004500	lisis mecánica
Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Cultivos bacterianos

bacterianos Espectrofotómetro de