Aislamiento de ARN diana bacteriano unido a ARN regulador pequeño mediante purificación por afinidad

Resumen

Fuente: Mercier, N., et. al., Purificación de afinidad MS2 acoplada con secuenciación de ARN en bacterias grampositivas. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el aislamiento de ARN regulador pequeño (ARNs) marcado con MS2 unido a su ARN diana bacteriano mediante purificación por afinidad con una fusión de proteína de recubrimiento MS2 de proteína de unión a maltosa (MBP) inmovilizada en resina de amilosa.

Protocolo

Tampones y medios

Para los experimentos MAPS, prepare los siguientes tampones y medios:- Tampón A (150 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl pH 8, 1 mM de MgCl₂ y 1 mM de DTT)- Tampón E (250 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl pH 8, 12 mM de maltosa, 0,1 % de Tritón, 1 mM de MgCl₂ y 1 mM de DTT)

Preparación de la columna

PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no permitir que la resina de amilosa se seque. Si es necesario, selle la columna con una tapa de extremo. Prepare todas las soluciones antes de comenzar la purificación por afinidad.

1. Coloque una columna de cromatografía en un bastidor de columnas.
2. Ret....

Resultados

Figura 1. Ilustración esquemática del protocolo MAPS adaptado a Staphylococcus aureus. Desde la construcción de plásmidos hasta el análisis de datos.

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Materiales