Aislamiento de ARN diana bacteriano unido a ARN regulador pequeño mediante purificación por afinidad

Resumen

Fuente: Mercier, N., et. al., Purificación de afinidad MS2 acoplada con secuenciación de ARN en bacterias grampositivas. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el aislamiento de ARN regulador pequeño (ARNs) marcado con MS2 unido a su ARN diana bacteriano mediante purificación por afinidad con una fusión de proteína de recubrimiento MS2 de proteína de unión a maltosa (MBP) inmovilizada en resina de amilosa.

Protocolo

Tampones y medios

Para los experimentos MAPS, prepare los siguientes tampones y medios:- Tampón A (150 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl pH 8, 1 mM de MgCl₂ y 1 mM de DTT)- Tampón E (250 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl pH 8, 12 mM de maltosa, 0,1 % de Tritón, 1 mM de MgCl₂ y 1 mM de DTT)

Preparación de la columna

PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no permitir que la resina de amilosa se seque. Si es necesario, selle la columna con una tapa de extremo. Prepare todas las soluciones antes de comenzar la purificación por afinidad.

1. Coloque una columna de cromatografía en un bastidor de columnas.
2. Retire la punta de la columna y lave la columna con agua ultrapura.
3. Añadir 300 μL de resina de amilosa.
4. Lave la columna con 10 ml de tampón A.
5. Diluya 1.200 pmol de proteína MBP (proteína de unión a maltosa)-MS2 en 6 ml de tampón A y cárguela en la columna.
6. Lave la columna con 10 ml de tampón A.

Purificación por afinidad MS2 (Figura 1)

1. Cargue el lisado celular en la columna.
   NOTA: Mantenga 1 ml del lisado celular (extracto crudo, CE) para extraer el ARN total y realizar análisis transcriptómicos y de transferencia de Northern.
2. Recoja la fracción de flujo continuo (FT) en un tubo de recolección limpio.
3. Lave la columna 3 veces con 10 ml de tampón A. Recoja la fracción de lavado (W).
4. Eluya la columna con 1 ml de tampón E y recoja la fracción de elución (E) en un microtubo de 2 ml.
5. Mantenga todas las fracciones recolectadas en hielo hasta la extracción de ARN o congélelas a -20 ° C para su uso posterior.

Resultados

Figura 1. Ilustración esquemática del protocolo MAPS adaptado a Staphylococcus aureus. Desde la construcción de plásmidos hasta el análisis de datos.

Materiales