Cultivo y aislamiento de cepas bacterianas patógenas formadoras de cápsulas

Resumen

Fuente: Feltwell, T., et.al. Separación de bacterias por cantidad de cápsulas utilizando un gradiente de densidad discontinuo. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la preparación y caracterización de cepas bacterianas con producción variable de cápsulas. Las cepas patógenas portadoras de diferentes mutaciones en genes relacionados con la cápsula se cultivan, se cultivan en medios líquidos y se someten a centrifugación para distinguir los fenotipos de la cápsula en función de la densidad de los gránulos. El tratamiento tampón se utiliza para lavar y estabilizar las células mientras se preservan sus estructuras de cápsulas.

Protocolo

1. Preparación de cepas bacterianas o bibliotecas mutantes

1. Elimine las cepas que se van a probar en placas de agar apropiadas. Estas son placas de stock para el experimento.

1. Incube las placas durante la noche a la temperatura deseada para lograr colonias individuales. Para este experimento, cultive K. pneumoniae (NTUH-K2044 y cepas ATCC43816) en agar caldo Luria (LB) a 37 ° C, y S. pneumoniae (tipo salvaje 23F y 23F Δcps) en agar sangre en un frasco de vela humidificado a 37 ° C.

2. Elija una sola colonia de una placa de caldo (paso 1.1) para inocular 10 ml de caldo apropiado usando un asa estéril o un palillo de cóctel. Para el cribado de bibliotecas mutantes aleatorias, inocular el caldo con 10 μL del stock de bibliotecas mutantes aleatorias (Biblioteca TraDIS).

1. Incubar cepas de K. pneumoniae en medios LB bajos en sal a 37 °C con agitación, y cepas de S. pneumoniae en medios de infusión cerebro-corazón (BHI), estáticamente a 37 °C.

2. Transfiera el cultivo durante la noche a un tubo de 15 ml y centrífuzcalo en una centrífuga de sobremesa durante 10 min a 3.200 x g en cubos abatibles con insertos de tubo de 15 ml y tapas herméticas al aerosol.

3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

NOTA: Deseche el sobrenadante a través de la ruta de desechos biológicos líquidos adecuada en el laboratorio. El propósito de los pasos de centrifugación y resuspensión (1.2.2 y 1.2.3) es concentrar las bacterias para facilitar la visualización en el gradiente. Los cultivos bacterianos se pueden cargar directamente en el gradiente si se prefiere. Las cepas muy encapsuladas pueden no formar un gránulo apretado. Si esto ocurre, elimine la mayor cantidad posible de sobrenadante sin eliminar ninguna célula bacteriana, agregue 1x PBS hasta un volumen final de 5 ml y vuelva a suspender el sedimento. Continúe el protocolo con el paso 1.2.5.

5. Centrifuga los tubos como se describe en el paso 1.2.2.

6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 2 ml de 1x PBS. Las celdas ahora están listas para usar.

NOTA: La densidad de la suspensión de células bacterianas no es crítica, pero debe ser suficiente para la visualización en el gradiente. Se sugiere un DO mínimo de₆₀₀ (densidad óptica a 600 nm) de 4.

Materiales