Separación de bacterias por cantidad de cápsula utilizando un gradiente de densidad discontinuo

Abstract

Fuente: Feltwell, T., et.al. Separación de bacterias por cantidad de cápsulas utilizando un gradiente de densidad discontinuo. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el uso de un gradiente de densidad discontinuo para separar cepas bacterianas según la cantidad de cápsulas. Al centrifugar una biblioteca mutante de transposones a través del gradiente, las bacterias con diferentes densidades de cápsulas se localizan en distintas capas. Las fracciones separadas se pueden recolectar para su análisis posterior.

Protocol

1. Adición de células preparadas a gradientes y separación por centrifugación

1. Agregue 600 μL de células preparadas a la parte superior del gradiente en el tubo muy lentamente y sin mezclar la interfaz.
2. Coloque los tubos en adaptadores de tubo y pese los adaptadores y tubos combinados para asegurarse de que estén equilibrados.
   1. Coloque los adaptadores de tubo en un rotor de ángulo fijo dentro de una centrífuga de sobremesa. Centrifugar durante 30 min a 3.000 x g.
   2. Después de la centrifugación, retire con cuidado los tubos, colóquelos en una rejilla adecuada y fotografíe los resultados como registro.
3. Recuperar las fracciones bacterianas para la cuantificación del ácido urónico o la extracción de ADN.
   1. Si no se requieren aplicaciones posteriores, elimine las muestras/gradientes a través de la ruta de desechos biológicos líquidos adecuada en el laboratorio.
      NOTA: Es importante validar la separación para nuevas especies/cepas de bacterias. Las fracciones individuales del gradiente deben examinarse mediante microscopía, ensayo de ácido urónico u otro ensayo cuantitativo adecuado para confirmar el fenotipo de la cápsula de cada fracción. Si el objetivo es separar en función de la agregación o el tamaño de la celda, se deben utilizar ensayos independientes apropiados.

Materials