Acústica asistida por aptámeros para la separación microfluídica de bacterias gramnegativas

Resumen

Fuente: Choi, H. J., et al. Acústica microfluídica para la separación fluvial de bacterias gramnegativas mediante perlas de afinidad de aptámeros. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el método de separar selectivamente bacterias gramnegativas de una muestra bacteriana mixta utilizando microperlas recubiertas de aptámero y fuerzas acústicas dentro de un chip microfluídico.

Protocolo

1. Configuración y funcionamiento de la acuostoforesis
   1. Conecte los tubos de polieteretercetona (PEEK) a las dos entradas para inyectar dos muestras y tampón, y las dos salidas para recoger y descargar residuos (Figura 1).
   2. Llene manualmente el canal de acústica microfluídica con agua desmineralizada sin burbujas con una jeringa de 10 ml.
   3. Prepare un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida para controlar el flujo de fluido. Luego, llene hasta la mitad los viales con muestra y tampón, respectivamente, con dos orificios en sus tapas, y conéctelos a la entrada del chip.
      NOTA: Un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida se puede reemplazar con múltiples controladores de presión de precisión. En la entrada del tampón, se inyecta un tampón capaz de generar un flujo laminar que evita que la muestra se mueva hacia el centro durante la inyección de la muestra a través de un controlador de flujo.
   4. Después de preparar el dispositivo, inyecte la muestra y el tampón aplicando una presión de 2 kPa a la entrada de la muestra y 4 kPa a la entrada del tampón utilizando el dispositivo de control de presión de precisión.
      NOTA: En este momento, para un flujo laminar suave, la presión de inyección del tampón debe ser mayor que la presión de inyección de la muestra. El flujo está controlado por un controlador de flujo fijado al aspirador conectado al canal de entrada.
   5. Concéntrese en una perla usando el transductor piezoeléctrico (PZT) para moverla hacia el centro del canal microfluídico mientras verifica a través del microscopio.
      NOTA: Cuanto más grande sea la perla, mayor será el efecto en la forma de onda, por lo que es más fácil alinearla con el punto del nodo. Un generador de funciones con un amplificador aplica energía al PZT para generar una onda sinusoidal en el microcanal. Dado que las partes superior e inferior del microcanal están hechas de vidrio, la onda sinusoidal generada se refleja y crea un punto de nodo.
   6. Usando un generador de funciones de un solo canal, genere una frecuencia de resonancia de 3.66 MHz y amplifique una señal típica en 16 dB (aproximadamente nueve veces) usando un amplificador de potencia (Figura 1).
      NOTA: La frecuencia de resonancia del actuador debe coincidir con el tamaño del canal, debido a que el canal es cuadrado, el PZT opera a una frecuencia precisa para crear un solo nodo.
   7. Observe los procesos de separación y enriquecimiento en el chip acústico con un microscopio de fluorescencia y una cámara de alta velocidad que funciona a 1.200 fps (fotogramas por segundo).
   8. Cuantifique y analice la presencia o ausencia de bacterias Gram-negativas (GN) y bacterias Gram-positivas (GP) verificando las imágenes tomadas con la cámara del microscopio de fluorescencia de las perlas y bacterias unidas a las bacterias descargadas a través de las muestras de recolección y salida de desechos.
      NOTA: Las microperlas con tampón, bacterias y aptámeros pasan a través del canal principal, y las microperlas se alinean centralmente a través de la acustoforesis en el chip inducida por el PZT. Finalmente, las microperlas que se han unido a las bacterias GN se recolectan en la salida de recolección y las bacterias no recolectadas se descargan a través de la salida de desechos.

Resultados

Figura 1: Esquema del sistema acústico utilizado para separar y recolectar celdas. La muestra o la solución tampón se inyecta en el puerto de entrada a través del controlador de flujo. Para el centrado de cordones y la separación de mues...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 μm Microperlas recubiertas de estreptavidina	Bang Laboratories	CP01007	Perlas de afinidad de aptámeros Aptamer
	Integrated DNA Technologies	GN3-6'ARN	para la conjugación de bacterias
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Bacterias objetivo
Generador funcional	GW Instek	AFG-2225	Frecuencia de generación
Cámara de alta velocidad	Photron	FASTCAM Mini	Observación de separación
KOVAX-SYRINGE Jeringa de 10 mL Koreavaccine		22G-10ML	Llene el canal de acuostoresis microfluídica con agua desmineralizada sin burbujas.
Microscopio	Olympus Corp.	IX-81	Observación de la separación de
los tubos de PEEK	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Inyectar o recoger partículas
Transductor piezoeléctrico	Fuji Ceramics	C-213	Generar onda específica en el canal
Amplificador de potencia	Investigación del amplificador	75A250A	Amplificar la frecuencia
Controlador de presión/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Control de la presión de aire/controlador de flujo