Ensayo in vivo para correlacionar la bioluminiscencia bacteriana con la densidad celular

Resumen

Fuente: Brodl, E., et al. Medición in situ y correlación de la densidad celular y la emisión de luz de bacterias bioluminiscentes. J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra la medición y correlación de la bioluminiscencia con la densidad celular en bacterias transformadas. Se utiliza una sola colonia bacteriana para iniciar un cultivo líquido. El cultivo se coloca en un pocillo a la concentración celular deseada. Se agregan un antibiótico y un inductor para expresar el gen requerido para la bioluminiscencia bacteriana. Las lecturas de absorbancia y bioluminiscencia se toman a intervalos regulares utilizando un lector de placas.

Protocolo

1. Diseño, preparación y expresión del operón lux en Escherichia coli

Nota: Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre los kits comerciales utilizados en esta sección.

1. Para transferir el operón lux a E. coli, elija un vector pET estándar con sitios de restricción apropiados y un gen de resistencia a antibióticos de interés (p. ej., pET28a; NcoI, XhoI, kanamicina).
2. Diseñe los fragmentos y cebadores superpuestos para el ensamblaje de Gibson basándose en la secuencia de ADN de Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. Configure una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar con los cebadores diseñados y el ADN genómico aislado (ácido desoxirribonucleico) de Photobacterium mandapamensis 27561 como plantilla.
   NOTA: El aislamiento del ADN genómico de la cepa bacteriana respectiva mejora la eficacia de la PCR.
4. Purifique el producto de PCR mediante la purificación de la columna de centrifugación.
5. Realice la digestión de restricción del vector pET28a aislado con NcoI y XhoI a 37 °C durante 45 min.
6. Purifique el vector linealizado y los fragmentos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior purificación en columna de espín.
7. Determine la concentración de ADN de cada fragmento y del vector linealizado, y calcule las cantidades óptimas para el ensamblaje de acuerdo con el protocolo.
   NOTA: La eficacia del ensamblaje depende del tamaño y número del fragmento y debe ajustarse de acuerdo con el protocolo del fabricante.
8. Después de combinar todos los fragmentos y el tampón en un tubo de PCR, incubar la mezcla de ensamblaje en una máquina de PCR a 50 °C durante 1 h.
9. Transformar el producto vectorial ensamblado de acuerdo con los protocolos de transformación estándar para la transformación de plásmidos bacterianos de E. coli en un sistema apropiado de E. coli para la replicación de plásmidos de alto rendimiento (por ejemplo, E. coli TOP10 o XL-1).
10. Recoge colonias de la placa de transformación y raya nuevas placas para aislar el ADN.
11. Aísle el ADN plasmídico de acuerdo con los protocolos estándar.
12. Para verificar el correcto ensamblaje del plásmido, incluidos todos los fragmentos, primero realice una PCR de colonias de acuerdo con los protocolos estándar utilizando cebadores específicos para cada fragmento ensamblado.
13. Además de la PCR de colonias y la posterior electroforesis en gel de agarosa, prepare todos los vectores de ensamblaje aislados para la secuenciación de ADN para verificar el ensamblaje correcto y las secuencias de ADN correctas.
14. Transforme el plásmido verificado de acuerdo con los protocolos de transformación estándar para la transformación de plásmidos bacterianos de E. coli en un sistema de E. coli apropiado para la producción de proteínas de alto rendimiento (p. ej., E. coli BL21).
    NOTA: Continúe directamente con el protocolo de expresión a continuación. Para un almacenamiento más prolongado, se recomienda la preparación de un caldo de glicerol.

2. Expresión de cepas de E. coli modificadas

1. Prepare un cultivo nocturno (ONC) para su expresión mediante la inoculación de un volumen apropiado de medio Luria-Bertani (LB) (por ejemplo, 100 ml) con el stock de glicerol previamente preparado de las células de E. coli BL21 transformadas con el plásmido ensamblado o directamente de una placa de transformación. Agregue 100 μL de kanamicina (50 mg / mL; gen de resistencia a antibióticos de pET28a) e incube el ONC a 37 ° C y 120 rpm en un agitador de incubadora durante la noche.
2. Inocular el cultivo de expresión principal (p. ej., 800 ml de medio LB) con 8 ml de ONC y agregar 800 μl de kanamicina (50 mg / ml).
3. Incubar el cultivo principal a 37 °C y 120 rpm en un agitador incubador hasta que la densidad celular alcance un OD₆₀₀ de 0,6 - 0,8 (aproximadamente 2,5 h).
4. Reduzca la temperatura de incubación a 28 °C.
5. Induzca la expresión de proteínas agregando propil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,1 mM.
   NOTA: Las pruebas empíricas mostraron que la reducción de la temperatura a 28 °C dio la mayor intensidad de luz.
6. Observe las células hasta que comiencen a brillar (aproximadamente 1 h).
   NOTA: Dependiendo del propósito de la expresión, las células se cultivan hasta el día siguiente y luego se cosechan, o las células se pueden mantener temblando mientras estén brillando (máximo 48 h). La recolección de las células y la purificación de cualquier proteína se pueden realizar de acuerdo con los procedimientos estándar.

3. Expresión de cepas bioluminiscentes bacterianas

NOTA: Las cepas bioluminiscentes bacterianas requieren un medio de crecimiento específico / medio de agua de mar artificial para el crecimiento y la producción de luz.

1. Prepare un medio de agua de mar artificial compuesto por dos componentes de medio preparados por separado.
   NOTA: Las siguientes cantidades son para 1 L de medio líquido o 1 L de medio agar.
   1. Para el medio artificial de agua de mar, pesar en las siguientes sales: 28,13 g de NaCl (cloruro de sodio), 0,77 g de KCl (cloruro de potasio), 1,60 g de CaCl₂ · 2H₂O (cloruro de calcio dihidratado), 4,80 g de MgCl₂ · 6H₂O (cloruro de magnesio hexahidratado), 0,11 g de NaHCO₃ (bicarbonato de sodio) y 3,50 g de MgSO₄ · 7H₂O (sulfato de magnesio heptahidratado).
   2. Añadir 1 L de agua destilada y disolver todos los componentes.
   3. Para LB medio, pese los siguientes ingredientes: 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona y para placas de agar, 20 g adicionales de agar.
   4. Añadir 250 ml de agua del grifo y disolver los componentes.
   5. Esterilizar en autoclave ambos medios preparados por separado a 121 °C durante 20 min.
   6. Para placas de agar, combine 250 ml de medio LB con 750 ml de medio de agua de mar artificial directamente después del autoclave y prepare las placas.
   7. Para el medio líquido, combine 250 ml de medio LB con 750 ml de medio de agua de mar artificial, ya sea directamente después del autoclave o cuando se enfríe.
      NOTA: El medio artificial de agua de mar puede volverse turbio a través de la precipitación salina.
2. Rayar las cepas bioluminiscentes bacterianas en placas de agar de medio de agua de mar artificial e incubar durante la noche a 24 - 30 °C.
   NOTA: El almacenamiento prolongado de las cepas bacterianas se logra normalmente mediante la congelación de las existencias de glicerol del cultivo bacteriano. Las cepas siempre deben rayarse primero en las placas de agar para asegurar condiciones de inicio uniformes para todas las cepas, antes de su uso para cultivos líquidos, debido a una fase de retraso en el crecimiento después de la descongelación.
3. Prepare un ONC inoculando 100 ml de medio de agua de mar artificial con una sola colonia de la placa. Incube el ONC a 24 - 30 °C y 120 rpm en un agitador de incubadora durante la noche.
4. Inocular 800 mL de medio artificial de agua de mar con 8 mL de ONC.
5. Incube las células bacterianas a 24 - 30 °C y 120 rpm en un agitador de incubadora.
   NOTA: El perfil de intensidad de luz de las bacterias bioluminiscentes varía mucho con la temperatura. Dependiendo de los mecanismos reguladores de la producción de luz de la cepa bacteriana respectiva, la emisión de luz puede comenzar después de aproximadamente 1 a 6 h.
6. Observe los cultivos de células bacterianas hasta que comiencen a brillar (aproximadamente 1 - 6 h).
   NOTA: Dependiendo del propósito de la expresión, las células se cultivan hasta el día siguiente y luego se cosechan, o las células se pueden seguir agitando mientras estén brillando. La recolección de las células y la purificación de cualquier proteína se pueden realizar de acuerdo con los procedimientos estándar.

4. Ensayo de actividad in vivo para cepas bioluminiscentes bacterianas y cepasmodificadas de E. coli

NOTA: El almacenamiento prolongado de cepas se logra normalmente mediante la congelación de las existencias de glicerol del cultivo bacteriano. Las cepas siempre deben rayarse primero en las placas de agar para asegurar condiciones de inicio uniformes para todas las cepas, antes de su uso para cultivos líquidos, debido a una fase de retraso en el crecimiento después de la descongelación.

1. Raye la cepa bacteriana bioluminiscente deseada o la cepa de E. coli modificada en una placa de agar e incube a 28 ° C durante la noche.
   NOTA: La temperatura de incubación puede variar de una cepa a otra y debe evaluarse empíricamente. Para poder comparar cepas bacterianas bioluminiscentes y cepas de E. coli modificadas, las condiciones de crecimiento deben ser idénticas.
2. Inocular 3 mL de medio con la cepa respectiva con una sola colonia de una placa de agar e incubar las células a 28 °C y 180 rpm en un agitador incubador durante aproximadamente 1 - 2 h.
3. Mida la densidad celular de una dilución 1:10 del cultivo líquido a 650 nm. Calcule la relación y el volumen para un cultivo de 1 ml con un OD650 de 0.05.
   NOTA: El ensayo posterior del lector de placas determinará la densidad celular a 650 nm para evitar interferencias por la emisión de luz de las cepas.
4. Pipetee el volumen calculado de cultivo y medio en una placa de paredes negras de 24 pocillos con fondo de vidrio. Para la cepa de E. coli modificada, agregue 1 μL de kanamicina (resistencia a antibióticos del vector pET28a) y 1 μL de IPTG (inducción de la expresión génica) a las muestras. Coloque una tapa en la placa para evitar la evaporación durante las mediciones.
   NOTA: Para asegurar que el vector pET28a que contiene todo el operón lux no se pierda por el cultivo de E. coli, se debe agregar kanamicina a cada muestra de E. coli en los pocillos de la placa y para asegurar que se pueda medir la producción de luz de las células de E. coli, la expresión génica debe ser inducida por IPTG. Para evitar la diafonía y la interferencia de medición, las placas de pocillos de paredes negras con fondo de vidrio y tapas transparentes mostraron los mejores resultados. Sin embargo, se puede observar diafonía y las posiciones de los pozos deben elegirse con cuidado.
5. Inicie la medición en un lector de placas.
   NOTA: El protocolo del lector de placas se basa en un script especialmente desarrollado para este ensayo que combina dos mediciones, absorbancia y bioluminiscencia. Los puntos de datos se recopilan cada 10 minutos con agitación permanente entre las mediciones y una temperatura constante de 28 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NEBuilder Kit de clonación de ensamblaje de ADN de alta fidelidad	New England Biolabs Inc.	E2621S	para 10 rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polymerasa	Thermo Scientific	F530S
Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet	Thermo Scientific	K0721	de 50 rxn
y tampón (NcoI, XhoI)	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Wizard SV Kit de limpieza de gel y PCR	Promega	A9282	para 250 rxn
Kit de extracción de gel de ADN Monarch	New England Biolabs Inc.	#T1020S	para 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0503	para 250 rxn
GoTaq G2 DNA Polymerasa	Promega	M7841
Sensoplate negro de 24 pocillos con fondo de vidrio	Greiner Bio One	662892
FLUOStar Omega lector de placas	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysis Software	BMG Labtech		Versión 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker	Infors AG

Kit de Purificación de ADN Genómico para enzimas de restricción