Cultivo de bacterias Magnetospirillum y evaluación de su comportamiento magnetotáctico

Resumen

Fuente: Le Nagard, L., et al. Bacterias magnetotácticas en crecimiento del género Magnetospirillum: cepas MSR-1, AMB-1 y MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra cómo cultivar bacterias Magnetospirillum en condiciones microaeróbicas utilizando medios líquidos y semisólidos. Destaca la formación de una banda bacteriana visible en la interfaz óxico-anóxica y su migración ascendente a medida que se agota el oxígeno. El video también muestra cómo evaluar el comportamiento magnetotáctico observando la natación direccional en respuesta a un campo magnético.

Protocolo

1. Inoculación de bacterias magnetotácticas (MTB)

NOTA: Los cultivos de las cepas AMB-1, MS-1 y MSR-1 se pueden obtener comercialmente (Tabla de materiales).

PRECAUCIÓN: Realice todos los pasos siguientes en condiciones estériles, bajo la llama de un mechero Bunsen.

1. Inoculación de las cepas MSR-1, AMB-1 y MS-1 en medio líquido
   1. Selle un frasco de suero vacío de 125 ml con un tapón de caucho butílico y un sello de engarzado de aluminio. Inserte dos agujas en el frasco a través del tapón y conecte una jeringa a una de ellas. Conecte la jeringa a un cilindro de Ø₂ a través del mismo tipo de tubo que el utilizado para la estación N₂.
   2. Deje que el O₂ fluya a través de la botella durante unos 30 minutos para asegurarse de que todo el aire de la botella sea reemplazado por O₂. Retire ambas agujas, permitiendo una ligera sobrepresión en la botella, y luego autoclave. Deje que la botella se enfríe a temperatura ambiente antes de usarla.
      NOTA: Para ahorrar tiempo, realice los pasos 1.1.1 y 1.1.2 durante la preparación del medio y autoclave la botella junto con el medio o las soluciones madre.
   3. Esterilice la parte superior de los tapones tanto de la botella de medio fresco como de la botella de O₂ aplicando unas gotas de solución de etanol al 70% encima y pasándolas por la llama de un mechero Bunsen.
   4. Con una jeringa estéril y una aguja, extraiga 1 ml de O₂ del frasco de O₂ y transfiéralo al frasco de medio fresco. Asegúrese de que la aguja encaje bien en la jeringa durante este paso para evitar que entre aire en la jeringa.
   5. Si usa el inóculo de otro cultivo cultivado en una botella de vidrio, esterilice los tapones tanto de la botella de medio fresco como de la botella de cultivo más vieja aplicando unas gotas de solución de etanol al 70% encima y pasándolas por la llama de un mechero Bunsen. Si usa el inóculo de un tubo de cultivo congelado, simplemente déjelo calentar a temperatura ambiente con el tubo sellado bajo la llama de un mechero Bunsen.
   6. Si usa el inóculo de otro cultivo cultivado en una botella de vidrio, inocule 1 ml del cultivo más antiguo en el medio fresco. Si usa el inoculado de un caldo congelado, inocule solo 0.1 ml para diluir el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO) utilizados en el proceso de congelación. En ambos casos, use una aguja estéril y una jeringa estéril.
   7. Incubar el cultivo a 32 °C e inocularlo en medio fresco después de 4 a 7 días.
2. Inoculación de MSR-1 en un medio semisólido de gradiente O₂
   1. Verifique que el tubo de medio fresco muestre una interfaz óxico-anóxica (OAI) bien definida, materializada por una interfaz de color rosa a incoloro.
   2. Si el inóculo proviene de otro cultivo semisólido con gradiente de concentración de O₂, coseche las bacterias pipeteando 50 μL del cultivo con una punta de pipeta estéril colocada en la banda formada por las bacterias. Inocular lentamente estas bacterias en el OAI en el medio fresco (interfaz rosa/incolora), evitando perturbar la interfaz. Si el inóculo proviene de un cultivo congelado, proceda de la misma manera con 100 μL de inóculo.
   3. Selle el tubo y deje que las bacterias crezcan entre 25 °C y 30 °C. Transfiera a un medio nuevo utilizando el mismo procedimiento antes de que la banda de bacterias llegue a la superficie del medio.

2. Observación de las bacterias

1. Esterilice el tapón de la botella de cultivo aplicando una solución de etanol al 70% encima y pasándola por la llama de un mechero Bunsen. Para un medio semisólido, abra el tubo bajo la llama de un mechero Bunsen. Use una aguja estéril y una jeringa estéril para extraer las bacterias.
2. Utilice el método de la gota colgante8 para asegurarse de que las bacterias sean magnéticas y móviles.
   NOTA: La microscopía de contraste de fase da excelentes resultados, pero no es obligatoria. Son adecuados aumentos que van de 10X a 60X.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
L-cisteína.HCl.H₂O	Jeringas Sigma-Aldrich	C7880-100G
1.0 mL Agujas	Fischer scientific	B309659
25G x 1 BD		305125
125 mL botellas de suero	Wheaton	223748
20 mm sellos de aluminio	Wheaton	224223-01
20mm E-Z Crimp	Wheaton	W225303
Tapones de caucho butílico	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Tubos de húngaro	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Tapón de tabique, 13 mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Tubos de cultivo de vidrio	Corning (VWR)	9826-16X