Un método de microdilución en caldo para pruebas de susceptibilidad a antibióticos de bacterias grampositivas

Abstract

Fuente: Koeth, L. M., et. al., Un método de microdilución de caldo de referencia para pruebas de susceptibilidad in vitro a dalbavancina de bacterias que crecen aeróbicamente. J. Vis. Exp. (2015).

Este video demuestra el método de microdilución en caldo para determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de un antibiótico lipoglicopéptido contra bacterias grampositivas. Cubre el aislamiento de colonias bacterianas, la dilución, la inoculación de pocillos de microplacas con diferentes concentraciones de antibióticos y la verificación de la pureza del cultivo y los recuentos celulares. El video también explica cómo la unión de antibióticos interrumpe la síntesis de la pared celular, lo que lleva a la lisis, y cómo identificar la CMI en función de la inhibición visible del crecimiento.

Protocol

1. Preparar diluciones del panel de CMI

1. Preparar una solución madre no superior a 1.600 μg/ml de dalbavancina en dimetilsulfóxido (DMSO) puro (puro) en tubos estériles de vidrio o plástico, y utilizar el mismo día de la preparación o almacenar a -20 a -60 °C o menos para su uso futuro en un congelador sin descongelación. Tenga en cuenta la potencia de la dalbavancina según lo dispuesto en la documentación recibida con el polvo al pesar el polvo.
2. Diluya la dilución de la pasta de manera similar al esquema con DMSO puro en tubos estériles de vidrio o plástico. Utilice una pipeta para medir el diluyente y otra pipeta para añadir el stock inicial de dalbavancina al primer tubo. Para cada concentración subsiguiente de dalbavancina, utilice una pipeta nueva.
3. Prepare 100X diluciones finales de concentración de panel de CMI (concentraciones intermedias) con DMSO puro. Combine volúmenes apropiados de fuente y DMSO para lograr la concentración intermedia deseada (los volúmenes que se utilizarán dependerán de la cantidad de paneles de CMI que se fabriquen).
4. Preparar P80 al 0,004%: Preparar una solución de material de trabajo al 2% de P80 añadiendo 0,1 ml de P80 a 4,9 ml de dH₂O. Esterilizar pasando por un filtro de 0,22 μm y utilizar la solución el mismo día de la preparación. Prepare el diluyente de P80 al 0,004% haciendo una dilución 1:500 de P80 al 2% (por ejemplo, 0,3 ml de P80 al 2% a 149,7 ml de CAMHB).
5. Además, diluya las concentraciones intermedias 1:100 en caldo Mueller Hinton ajustado por cationes (CAMHB) suplementado con polisorbato-80 (P-80) al 0,004% (v/v) y/o LHB (para estreptococos) agregado al doble de la concentración final porque la adición de inóculo dará como resultado una dilución 1:2.

2. Prepare los paneles de MIC

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1. Dispense 50 μL de cada solución de dalbavancina preparada en los pocillos apropiados del panel de MIC, e incluya medios solo en un pocillo (pocillo de control de crecimiento). Para este paso se puede utilizar una pipeta multicanal con puntas estériles.
2. Use los paneles inmediatamente o séllelos con una película de plástico, colóquelos en bolsas de plástico y colóquelos inmediatamente en un congelador sin descongelación a ≤ -20 ° C (preferiblemente a ≤ -60 ° C) hasta que los necesite. Si se utilizan paneles congelados, retire los sellos y coloque los paneles individuales en la mesa de laboratorio durante 15 a 30 minutos (hasta que se descongele el contenido del pozo) antes de proceder a la inoculación del panel.

3. Inocular los paneles de MIC, realizar la pureza y configurar el recuento de colonias

1. Seleccione varias colonias bien aisladas de un agar sangre de 18 a 24 horas u otra placa de agar no selectiva. Toque la parte superior de cada colonia con un asa estéril o un hisopo y transfiéralo a 1-5 ml de CAMHB o solución salina hasta que la turbidez sea equivalente a un estándar de 0,5 McFarland. Evalúe la turbidez mediante comparación visual con el McFarland de 0.5 o con un dispositivo fotométrico.
2. Dentro de los 15 a 30 minutos posteriores a la preparación, diluya el inóculo 1:100 en CAMHB (100 μL en 10 mL de CAMHB). Para la mayoría de las bacterias probadas contra la dalbavancina, con la excepción de S. pneumoniae, esta dilución proporcionará una concentración final de pocillos de 5 × 10⁵ UFC/ml (el rango aceptable es de 2-8 × 10⁵ UFC/ml). Para S. pneumoniae, la concentración bacteriana basada en una comparación de turbidez con 0.5 McFarland suele ser considerablemente menor. Por lo tanto, diluya el inóculo 1:25 (400 μL en 10 mL CAMHB + 10% LHB).
3. Dentro de los 15 minutos posteriores a la preparación del inóculo, transfiera 50 μL del inóculo final a cada pocillo (con la excepción del pocillo de control de esterilidad) del panel de CMI preparado. Para este paso se puede utilizar una pipeta multicanal con puntas estériles.
4. Realice una comprobación de pureza transfiriendo y esparciendo una alícuota de 1-10 μl desde el pocillo de control de crecimiento positivo utilizando un asa estéril a un agar no selectivo (por ejemplo, agar de soja tripticasa con un 5% de sangre de oveja).
5. Configure el recuento de colonias retirando 10 μl del pocillo de control de crecimiento con una pipeta monocanal y una punta estéril y transfiriendo a 10 ml de solución salina (dilución 1:1.000). Mezclar y transferir 100 μL con una pipeta monocanal y una punta estéril a un medio de agar no selectivo adecuado (por ejemplo, agar de soja tripticasa con un 5% de sangre de oveja) y extender por toda la superficie del agar con un asa estéril, repitiendo dos veces en diferentes direcciones para asegurar una distribución uniforme del inóculo (dilución 1:10).

4. Incubar los paneles de MIC, el recuento de colonias y las placas

1. de pureza Selle cada panel de MIC o pila de no más de cuatro paneles en una bolsa de plástico con cinta de plástico o con una cubierta de plástico hermética antes de incubar. Alternativamente, coloque un panel MIC vacío en la parte superior de la pila de no más de 4 paneles MIC, coloque una toalla de papel húmeda en un recipiente de plástico, coloque los paneles MIC en el recipiente de plástico y cierre el recipiente de forma segura con una tapa. Incube los paneles de CMI en una incubadora de aire ambiente a 35 °C ± 2 °C durante 16-20 horas (estafilococos y enterococos) y 20-24 horas (estreptococos) dentro de los 30 minutos posteriores a la inoculación. Incubar el recuento de colonias y las placas de pureza en las mismas condiciones, excepto incubar estreptococos en una incubadora de CO₂ al 5%.

5. Lea las placas de recuento de colonias y MIC; Verifique la placa

1. de pureza Lea el CMI como la concentración más baja que inhibe completamente el crecimiento bacteriano en los pocillos según lo detectado a simple vista.
2. Cuente las colonias en la placa de conteo de colonias. Multiplique cada colonia por el factor de dilución (1:10.000) (por ejemplo, 50 colonias equivalen a 5 × 10⁵ UFC/ml). Un rango aceptable es de 20 a 80 colonias (2 a 8 × 10⁵ UFC/ml) y se utiliza como pauta aproximada.
3. Verifique la placa de pureza. Si todas las colonias son similares a cada colonia, entonces el inóculo puede considerarse puro. Si hay otras colonias presentes, existe la posibilidad de que haya un contaminante presente en el panel de MIC, y se debe repetir la prueba.

Materials