Visualización mediada por nanopartículas de la remodelación endolisosomal en células infectadas por bacterias

Resumen

Fuente: Zhang, Y., et al. Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar la remodelación del sistema endolisosomal por bacterias intracelulares. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra el uso de nanopartículas fluorescentes para visualizar la remodelación endo-lisosomal en células epiteliales humanas infectadas por bacterias intracelulares. Después de la invasión bacteriana, los patógenos manipulan el citoesqueleto del huésped y el sistema endolisosomal, formando vacuolas con proyecciones tubulares que alteran el transporte de vesículas. Luego, se utilizan nanopartículas marcadas con fluorescencia para rastrear estos cambios, lo que permite obtener imágenes de alta resolución de eventos de tráfico intracelular inducidos por patógenos.

Protocolo

1. Cultivo de células HeLa
   1. Las células HeLa que expresan permanentemente LAMP1-GFP (glicoproteína de membrana asociada a lisosomas 1-proteína fluorescente verde) se cultivan en el medio Eagle modificado de Dulbecco, o DMEM con 10% de suero fetal de ternera (FCS) y se cultivan a 37 °C en una atmósfera que contiene 5% de CO₂.
   2. Siembre las células a una densidad de 50,000 por pocillo en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos (Ibidi) e incube durante la noche (O / N).
2. Cultivo de Bacterias
   1. Utilizar Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12023 cepa de tipo salvaje (WT). A modo de comparación, utilice cepas mutantes ΔssaV defectuosas en el SPI2-T3SS y ΔsifA que carecen del efector clave SifA para SIF. Utilice cepas que alberguen pFPV25.1 para la expresión constitutiva de GFP mejorada.
      NOTA: Las cepas bacterianas se cultivan de forma rutinaria en caldo de Luria-Bertani (LB) con la adición de 50 μg/ml de carbenicilina (WT) y LB con la adición de 50 μg/ml de carbeniclina y/o 50 μg/ml de kanamicina (ΔssaV, ΔsifA) de los plásmidos necesarios para mantener.
   2. Inocular una sola colonia de bacterias en 3 ml LB con antibióticos apropiados y cultivar O/N a 37 ºC en condiciones de agitación para la aireación, luego diluir 1:31 en LB fresco y continuar el crecimiento durante 3,5 horas. En este momento, los cultivos alcanzan la fase logarítmica tardía y las bacterias son altamente invasivas. Un "tambor de rodillos" es conveniente para incubar cultivos de tubos de ensayo con aireación.
3. Infección de células HeLa por nanopartículas o NP de Salmonella y Gold-BSA-Rhodamine Marcaje de persecución de pulsos (ver Figura 1 para el esquema)
   1. Mida OD₆₀₀ de las bacterias subcultivadas y diluya a OD₆₀₀ = 0,2 en 1 ml Solución salina tamponada con fosfato o PBS (~3 × 10⁸ ufc/ml), agregue cantidades adecuadas de bacterias a las células HeLa en portaobjetos de cámara de 8 pocillos para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 100.
   2. Incubar durante 30 min en la incubadora celular, lavar 3 veces con PBS para eliminar las bacterias no internalizadas (este punto de tiempo se estableció en 0 horas después de la infección, o 0 horas por pi). Añadir 300 μl de medio de cultivo fresco que contenga 100 μg/ml de gentamicina y mantener durante 1 hora. A continuación, sustituya el medio por un medio fresco que contenga 10 μg/ml de gentamicina durante el resto del tiempo de incubación.
   3. Después de la incubación con medio de cultivo que contiene 100 μg/ml de gentamicina durante 1 hora, el medio se reemplaza por medio de imagen (MEM de Eagle sin FCS, L-glutamina, rojo de fenol y bicarbonato de sodio, con 30 mM HEPES, pH 7,4) que contiene 10 μg/ml de gentamicina. Las NP de oro-BSA-rodamina se agregan a las células HeLa para obtener una concentración final de OD₅₂₀ = 0.1. (Albúmina sérica bovina, o BSA)
      NOTA: Las NP de oro-BSA-rodamina también se pueden agregar a las células antes de la infección, o en varios puntos de tiempo p.i.
   4. Después de 1 hora de incubación, retire el medio, lave 3 veces con PBS y agregue 300 μl de medio de imagen fresco que contenga 10% de FCS y 10 μg/ml de gentamicina durante el resto del tiempo de incubación.
      NOTA: La duración de la incubación puede variar según la concentración de NP y las líneas celulares utilizadas. Para los macrófagos RAW264.7, observamos que la incubación de 30 min con NP a una concentración de DO₅₂₀ = 0.05 permitió una internalización suficiente.

Resultados

Figura 1. Esquema para la preparación de células HeLa para la obtención de imágenes de células vivas. Las células HeLa se sembraron en portaobjetos de cámara, se infectaron simuladamente o se infectaron con varias cepas de Salmonella d...

Materiales