Cultivo de Mycobacterium tuberculosis en condiciones limitadas por el hierro

Resumen

Fuente: Gupta, S., et al. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas en hierro. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el procedimiento para cultivar Mycobacterium tuberculosis en condiciones limitadas de hierro para inducir estrés ferropérico y promover la secreción de sideróforos que apoyan la supervivencia bacteriana.

Protocolo

1. Cultivo de micobacterias en condiciones limitadas de hierro

1. Descongele 50 μL de un stock congelado de glicerol al 15% de Mtb (Mycobacterium tuberculosis) y raye una placa de agar suplementada con un enriquecimiento de ADN (Albúmina - Dextrosa - NaCl) al 10% (5 g / L de albúmina, 2 g / L de dextrosa y 0,85 g / L de cloruro de sodio, 0,2% de glicerol y 0,05% de Tween-80). Incubar la placa a 37 °C hasta que las colonias sean visibles.
2. Inocular una sola colonia de Mtb en 2 mL de medio de caldo micobacteriano (Tabla de Materiales) suplementado con enriquecimiento de ADN. Incubar con agitación a 37 °C.
3. Deje que el cultivo de Mtb crezca hasta la fase logarítmica tardía (OD₅₄₀ es ~ 0.8). Para comprobarlo, mida el OD₅₄₀ con un espectrofotómetro.
4. Extienda 200 μL del cultivo logarítmico tardío en las placas de agar micobacteriano (Tabla de materiales) suplementadas con glicerol al 0,2%, Tween-80 al 0,05% y ADN. Inocular al menos 5 placas. Incubar las placas a 37 °C hasta que el crecimiento bacteriano sea visible como una capa confluente. Esto toma ~ 1 semana para Mtb.
5. Humedezca un hisopo de algodón estéril en LIMM (medio mínimo de hierro bajo). Utilice este hisopo para recolectar bacterias de las placas de agar e inocular 100 ml de LIMM para preparar una suspensión bacteriana concentrada con un DO₅₄₀ de ~ 1.0.
6. Diluya esta suspensión 10 veces a 1 L con LIMM y divídala en dos frascos de plástico estériles de 2 L, cada uno con 500 mL de cultivo.
7. Saque 2 ml de cultivo y transfiéralo a un tubo de cultivo de 5 ml. Añadir 10 μL de tyloxapol al 10% vol/vol.
8. Incubar los cultivos a 37 °C durante 14 días.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Placas de agar micobacteriano
Caldo Middlebrook 7H9	BD Difco	271310	Medio de caldo micobacteriano
Tubo centrífugo de polipropileno de pared fina 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	Tubo centrífugo de polipropileno de pared fina 13x15 mm
Matraces de filtración al vacío	CellPro	V50022	Unidad de filtro