Aislamiento de vesículas extracelulares que contienen sideróforos de Mycobacterium tuberculosis

Resumen

Fuente: Gupta, S., Marcela Rodríguez, G. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas en hierro. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el aislamiento escalonado de vesículas extracelulares (EV) de Mycobacterium tuberculosis cultivadas en condiciones limitantes de hierro que imitan el entorno del huésped. Describe el uso de la ultrafiltración, la centrifugación diferencial y la separación por gradiente de densidad para enriquecer e identificar fracciones que contienen EV.

Protocolo

1. Recolección de vesículas extracelulares micobacterianas (MEV)

1. Mida el DO₅₄₀ del cultivo de 2 mL en el momento de la recolección. Realizar diluciones seriadas 1:10 del cultivo y platear 100 μL de cada dilución en placas de agar con ADN y 0,05% Tween-80.
2. Transfiera el cultivo a cinco tubos de centrífuga cónicos de 225 ml y centrifugue a 2.850 x g durante 7 min a 20 °C.
3. Recoja el sobrenadante de cultivo con una pipeta de 50 ml y esterilícelo mediante un filtro a través de una unidad de filtro de 0,22 μm.

2. Aislamiento de MEV

1. Transfiera el filtrado de cultivo a un sistema de ultrafiltración de células agitadas colocado a 4 °C y filtre el concentrado a <50 psi a través de una membrana de corte de 100 kDa a ~50 mL.
2. Centrifugar el filtrado de cultivo concentrado a 15.000 x g durante 15 min a 4 °C y recoger el sobrenadante.
3. Centrifugar el filtrado de cultivo en tubos de ultracentrifugación de policarbonato a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C.
4. Vuelva a suspender los gránulos membranosos en un total de 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) mediante un pipeteo suave.
5. Mezcle 0,5 ml de la suspensión de pellets obtenida en el paso 2.4 con 1,5 ml de solución de yodixanol al 60%, lo que arroja una concentración final de yodixanol del 45% en peso / vol. Dispense esta mezcla en el fondo de un tubo de ultracentrífuga de paredes delgadas de polipropileno de 13 mm x 51 mm.
6. Superponga la suspensión MEV-yodixanol al 45% con 1 ml de soluciones de yodixanol al 40%, 35%, 30%, 25% y 20% (vol/vol en PBS) y 1 ml de PBS en la parte superior.
7. Centrifugar a 100.000 x g durante 18 h a 4 °C.
8. Recoja las fracciones de gradiente de densidad de 1 ml comenzando desde la parte superior con una jeringa Hamilton de 1 ml.
9. Diluir cada fracción recolectada a 20 mL con PBS y centrifugar a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C.
10. Retire el sobrenadante y suspenda el gránulo en 0,5 ml de PBS. Almacene este pellet a 4 °C.

Materiales