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1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
NOTA: Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio fueron Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium dentium.
1. Para E. coli, use un asa estéril para inocular colonias individuales en 250 a 1,000 ml de caldo Luria-Bertani (LB) e incube aeróbicamente en una incubadora agitadora a 300 rpm y 37 ° C durante 48 h antes de procesar el cultivo. Para la cepa recombinante de E. coli MP1 que alberga p114-mCherryClyluc, agregue cloranfenicol al agar LB y caldo a una concentración final de 17 μg / mL.
2. Para A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve y B. dentium, raye las placas de agar Brain Heart Infusion (BHI) e incube anaeróbicamente dentro de una cámara anaeróbica de vinilo. Inocular colonias individuales en 100 mL de caldo BHI pre-reducido e incubar durante 48 h anaeróbicamente.
2. Aislamiento de vehículos eléctricos
1. Clarificación del medio de cultivo bacteriano por centrifugación y filtración
1. Transfiera los cultivos de células bacterianas inoculados en el paso 1 para limpiar frascos de centrífuga de polipropileno de 250 ml o 500 ml mediante vertido. Centrifugar las botellas en un rotor de ángulo fijo de gran capacidad a 4 °C y 5.000 × g durante 15 min. Transfiera el sobrenadante a botellas de centrífuga limpias vertiendo cuidadosamente y centrifugue nuevamente a 10,000 × g durante 15 min.
NOTA: Reutilice las botellas después de la limpieza y descontaminación adecuadas para la bioseguridad.
1. Si hay grandes gránulos de células bacterianas después de la segunda centrifugación, repita la centrifugación en una botella limpia para eliminar aún más las células.
2. Transfiera el sobrenadante a un dispositivo de filtro de polietersulfona accionado por vacío de 0,22 μm del tamaño adecuado mediante vertido. Filtre conectando el dispositivo de filtración a un suministro de pared de vacío. Si la tasa de filtración disminuye significativamente, simplemente mueva cualquier material sin filtrar a un nuevo dispositivo. Almacene el medio filtrado a 4 °C durante la noche y continúe el protocolo al día siguiente si lo desea.
NOTA: Las centrifugaciones anteriores generalmente permiten el procesamiento de ~ 2 veces el volumen indicado de cultivo celular a través de cada dispositivo. Por ejemplo, un solo dispositivo de filtro de 500 ml podría filtrar ~ 1,000 ml de cultivo precentrifugado. Estos dispositivos no suelen reutilizarse. No se recomienda el uso de filtros de jeringa en este paso sin optimización, ya que se observaron pérdidas significativas con los modelos probados. Este es un punto de parada potencial.
3. Compruebe la eliminación completa de las células viables en este punto extendiendo una alícuota del sobrenadante filtrado en placas de agar adecuadas y asegúrese de la ausencia de colonias después de la incubación en condiciones óptimas para la cepa bacteriana. Si se detectan bacterias, optimice aún más el procedimiento anterior realizando centrifugaciones y/o filtraciones adicionales.
2. Concentración del medio filtrado
1. Si trabaja con volúmenes significativamente >100 ml, continúe con el paso 2.2.2. Si trabaja con volúmenes de ~100 ml, cargue 90 ml de medio de cultivo filtrado en el depósito de un dispositivo de ultrafiltración centrífuga de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa de capacidad respectiva utilizando pipetas serológicas. Equilibre siempre con un dispositivo de ultrafiltración adecuado y centrifugue en un rotor de cubo oscilante a 4 °C y 2.000 × g durante intervalos de 15-30 minutos, hasta que el volumen del medio en el depósito superior se haya concentrado en <0,5 ml.
1. Rellene el depósito con cualquier medio de cultivo filtrado restante. Si "se rellena", retire el flujo en la parte inferior del dispositivo y vuelva a equilibrar los dispositivos.
NOTA: Se observó que el volumen máximo de medio de cultivo filtrado que se puede concentrar con estos dispositivos es <2 veces el volumen recomendado.
2. Si la viscosidad del medio concentrado en el yacimiento aumenta visiblemente (material oscuro y viscoso), diluya con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y vuelva a concentrar por centrifugación para diluir cualquier proteína que no sea EV más pequeña que el MWCO de 100 kDa.
NOTA: Este es un punto de parada potencial.
3. Transfiera el medio concentrado a un tubo de baja unión a proteínas, guárdelo a 4 ° C durante la noche y continúe el protocolo al día siguiente si lo desea.
2. Si trabaja con volúmenes significativamente >100 ml, seleccione un dispositivo de filtración de flujo tangencial (TFF) del tamaño adecuado (100 kDa MWCO) para acomodar el volumen a procesar.
NOTA: Los dispositivos de filtración para procesar de 100 ml a > 1,000 ml están disponibles comercialmente. La disponibilidad local, el costo y la compatibilidad con la bomba y la tubería/conexiones dictarán qué modelos particulares serán más útiles. Se procesaron hasta 2 L de medio de cultivo con el dispositivo indicado en la Tabla de Materiales antes de tener que limpiar el filtro (consulte el paso 2.3 a continuación para conocer el protocolo de limpieza).
1. Ensamble un circuito de filtración con tubería # 16 de baja unión / baja lixiviación, adaptadores de manguera a Luer de 1/8 de pulgada, el dispositivo TFF y una bomba peristáltica.
NOTA: Realice TFF dentro de un gabinete de bioseguridad para minimizar el riesgo de contaminar la preparación de EV con bacterias ambientales.
2. A temperatura ambiente, comience a hacer circular el medio filtrado y acondicionado a aproximadamente 200 ml / min (mínimo 100 ml / min). Determine las RPM apropiadas correspondientes al caudal deseado bombeando 200 ml de PBS en un recipiente graduado. Cuando circula un medio filtrado y acondicionado, recolecte las moléculas <100 kDa que atraviesan la membrana de ultrafiltración como desechos en un recipiente separado.
NOTA: El siguiente ejemplo supondrá un volumen inicial de 2 L de cultivo.
3. Continúe haciendo circular el medio acondicionado hasta que su volumen se haya reducido a ~ 100-200 ml. Muévase a embarcaciones más pequeñas según sea necesario. Diluir 2 veces con PBS y continuar circulando con la bomba, concentrando hasta 75-100 ml. Diluir 2 veces con PBS y continuar circulando hasta un volumen final de 25 ml. Diluir 2 veces con PBS y continuar circulando hasta <10 ml.
4. Levante el tubo de alimentación del depósito de muestra y continúe bombeando para purgar el filtro y recuperar la cantidad máxima de muestra.
NOTA: Este es un punto de parada potencial.
5. Transfiera la muestra concentrada a un tubo cónico y guárdela durante la noche a 4 °C si lo desea. Alternativamente, continúe con el protocolo.
6. Mueva la muestra concentrada a un dispositivo de ultrafiltración centrífuga MWCO de 100 kDa de 15 ml de capacidad. Centrifugar en un rotor de cubo oscilante a 4 °C y 2.000 × g durante intervalos de 15-30 min hasta que el volumen del medio en el depósito superior se haya concentrado en <2 mL.
NOTA: Este es un punto de parada potencial.
7. Transfiera el medio concentrado a un tubo de baja unión a proteínas y guárdelo a 4 ° C durante la noche, continuando el protocolo al día siguiente si lo desea.