Aislamiento y enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de la membrana externa de bacterias

Resumen

Fuente: Watson, D. C., et.al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el aislamiento y la concentración de vesículas extracelulares (EV) derivadas de la membrana externa de bacterias modificadas genéticamente. El proceso consiste en cultivar las bacterias para liberar vehículos eléctricos, seguido de pasos secuenciales de centrifugación y filtración para eliminar células y desechos. Finalmente, la ultrafiltración se utiliza para concentrar los vehículos eléctricos para el análisis posterior.

Protocolo

1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

NOTA: Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio fueron Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium dentium.

1. Para E. coli, use un asa estéril para inocular colonias individuales en 250 a 1,000 ml de caldo Luria-Bertani (LB) e incube aeróbicamente en una incubadora agitadora a 300 rpm y 37 ° C durante 48 h antes de procesar el cultivo. Para la cepa recombinante de E. coli MP1 que alberga p114-mCherryClyluc, agregue cloranfenicol al agar LB y cal....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de PCR de pared delgada con tapa plana de 0,5 ml	Thermo Scientific	3430	es importante utilizar tubos de PCR de paredes delgadas para obtener lecturas precisas con Qubit
Solución acuosa de paraformaldehído (formaldehído) al 16%	Ciencias de la microscopía electrónica	15700
Frascos de centrífuga de polipropileno Fiberlite de 250 ml	ThermoFisher	010-1495
Frascos centrífugos de polipropileno Fiberlite de 500 ml	ThermoFisher	010-1493
Adaptador de botella cónica / de polipropileno de 65 mm	Beckman Coulter	392077	Permite que Vivacell encaje en el rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (MWCO de 100 kDa)	MilliporeSigma	UFC910024
Centrífuga Avanti J-20 XPI	Beckman Coulter		Ya no se vende por Beckman. Avanti J-26XP es el modelo contemporáneo más cercano.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI)	Himedia	M2101	Después del autoclave, tanto el caldo BHI como el agar se introdujeron en la cámara anaeróbica, suplementados con menadiona (1 μg / L), hematina (1,2 μg / L) y clorhidrato de L-cisteína (0,05%). Luego se incubaron durante al menos 24 h en condiciones anaeróbicas antes de la inoculación con las cepas bacterianas anaeróbicas.
Cartucho de microfluidos C-300	Spectradyne
Cloranfenicol	MP Biomédica	ICN19032105
Escherichia coli HST08 (Células competentes de Steller)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (regalo)		bacterias comensales derivadas del intestino del ratón
Adaptador Fiberlite de 500 ml a 250 ml	ThermoFisher	010-0151-05	utilizado con el rotor Fiberlite para permitir que se utilicen frascos de 250 ml para un tamaño más pequeño de cultivo bacteriano inicial
Rotor centrífugo de ángulo fijo Fiberlite	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	se adapta a 6 botellas de 500 ml
Caldo Lauria Bertani (LB), Miller	Difco	244620