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1. Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
NOTA: SEC se utiliza para aumentar la pureza de las vesículas extracelulares (EV) y eliminar proteínas no vesiculares.
- Utilice una columna SEC pequeña (volumen de lecho de 10 ml) para el aislamiento de vehículos eléctricos de <100 ml de material de partida y una columna más grande (volumen de lecho de 47 ml) para el aislamiento de vehículos eléctricos de >100 ml de material de partida.
NOTA: En el ejemplo siguiente se enumeran los volúmenes de la columna más grande, con los volúmenes de la columna más pequeña entre paréntesis. - Lleve la columna SEC y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente durante varias horas. Estabilice la columna SEC en posición vertical utilizando un soporte de laboratorio estándar. Alternativamente, utilice soportes de columna de cromatografía comerciales.
- Antes de conectarlo a la columna SEC, hidrate el depósito de muestra dejando que 5 ml de PBS fluyan a través de la frita y hacia un contenedor de desechos. Desenrosque la tapa de entrada de la columna SEC, agregue 2 ml de PBS al depósito de muestra y conecte con cuidado el depósito a la columna mientras el PBS gotea a través de la frita (no aplicable para columnas SEC pequeñas). NOTA: Este paso anterior evita que las burbujas de aire queden atrapadas en la parte superior de la columna SEC. Si queda aire atrapado, retire el depósito, golpee la columna para sacar la burbuja de aire y repita el procedimiento de conexión. Para la columna más pequeña, simplemente destape la parte superior de la columna SEC y coloque la tolva de muestras.
- Agregue 47 ml (10 ml) de PBS al depósito de muestra y destape la parte inferior de la columna SEC. Permita que todo el búfer de muestra cargado fluya a través de la columna para equilibrarlo. Deseche el flujo continuo.
- Cargue un máximo de 2 ml (0,5 ml) de muestra en el depósito de muestras, deseche el flujo continuo y deje que la muestra entre por completo en la columna.
- Agregue inmediatamente PBS al depósito de muestra o a la tolva a un volumen de 14,25 ml menos el volumen de la muestra (3 ml menos el volumen de la muestra, para la columna pequeña). Deje que la solución fluya a través de la columna y deseche esta cantidad igual al volumen vacío de la columna.
NOTA: Para una muestra típica de 2 ml, la cantidad de PBS que se agregará al depósito de muestra o a la tolva será de 12,25 ml. - Coloque un microtubo de baja unión de 2 ml directamente debajo de la columna SEC. Agregue inmediatamente 2 ml (0,5 ml) de PBS al depósito de muestra y deje que ingrese a la columna. Etiquete los primeros 2 ml (0,5 ml) de flujo continuo como Fracción 1. Continúe agregando 2 ml (0,5 ml) a la vez al depósito de muestra para recolectar cada fracción subsiguiente.
NOTA: La mayoría de las VE bacterianas eluyen en las primeras 5 fracciones. Durante la optimización, se recogieron las primeras 12 fracciones. - Almacene las fracciones a 4 °C para almacenamiento a corto plazo (días) o a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.