Transinfección bacteriana in vitro de células T mediante la formación de sinapsis inmunológicas

Resumen

Fuente: Cruz-Adalia, A., et al. Las células T capturan bacterias por transinfección de células dendríticas. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra la transinfección bacteriana a través de interacciones entre células T específicas de antígeno y células dendríticas. Las células dendríticas infectadas por bacterias que presentan péptido de ovoalbúmina se incuban con células T, ya sea directamente o separadas por una membrana. El contacto directo permite la formación de sinapsis inmunológicas, lo que permite la transferencia bacteriana, mientras que la membrana evita la interacción. Luego se realiza un tratamiento con gentamicina para eliminar las bacterias extracelulares.

Protocolo

Nota: Los ratones fueron criados en alojamientos libres de patógenos específicos (SPF) y fueron sacrificados por personal capacitado y calificado utilizando el método de inhalación de dióxido de carbono (CO₂).
1. Diferenciación e infección de células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratón (DC)Nota: La Figura 1 resume este primer paso. Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en la campana a partir de este momento, utilizando solo medios, instrumentos, puntas de pipeta y placas de cultivo estériles.

1. Diferenciación de CD derivadas de la médula ósea de ratón
   1. Diseccionar tibias y fémures de un ratón C57 / BL6 y transferirlos a un plato de plástico con 10 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
   2. Corta cada epífisis, con unas tijeras estériles y expone la médula ósea, que tiene un color rojo brillante característico.
   3. Infundir el interior del hueso con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tampón PBS/BSA/EDTA) utilizando una jeringa estéril en una placa de Petri estéril.
   4. Recoger la suspensión celular y centrifugar en un tubo a 600 x g en una centrífuga refrigerada (4 °C).
   5. Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK) (cloruro de amonio 0,15 M (NH₄Cl), bicarbonato de potasio 10 mM (KHCO₃) y EDTA 0,1 mM) e incube durante 30 segundos a temperatura ambiente (RT) para eliminar los glóbulos rojos.
   6. Añadir 10 ml de medio RPMI 1640 con suero fetal bovino (FBS) al 10% y filtrar a través de un colador celular (70 μm) para eliminar los fragmentos óseos y los grumos celulares antes de centrifugar a la misma velocidad (600 xg) porque los grumos se eliminaron por filtración.
   7. Contar las células y ajustar a 5 x 10⁵ células/ml con RPMI 10% FBS (que contiene 50 μM de B-mercaptoetanol, 1 mM de piruvato de sodio) y añadir 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos murinos recombinantes (rm-GM-CSF) como concentración final.
   8. Añadir esta suspensión a una placa de Petri estéril de calidad microbiológica de 15 cm y cultivar en una incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO₂).
   9. Cada tres días, centrifugar tanto las células no adherentes como las células desprendidas con 5 mM de EDTA en PBS y volver a suspender a 5 x 10⁵ células/ml de densidad celular, con medio fresco que contenga 20 ng/ml rm-GM-CSF.
2. Maduración de las CD y carga de antígenos
   1. En el día 9, resuspender las células a una densidad de 5 x 10⁵ células/ml en un medio que contenga 20 ng/ml rm-GM-CSF. A continuación, añadir 20 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) para permitir una alta expresión del complejo mayor de histocompatibilidad o MHC-II en las células e incubar en una placa de Petri estéril de 15 cm no tratada con cultivo de tejidos durante 24 horas.
   2. Después de un día de estimulación con LPS, tiña algunas células DC con anticuerpos contra CD11c, MHC-II y receptor de granulocitos-1 o Gr-1 de ratón para verificar la diferenciación de DC mediante citometría de flujo. En las Figuras 3A y 3B se muestra un ejemplo de análisis de citometría de flujo de DC.
      1. Incubar CD (5 x 10⁵ células/muestra) con un anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 de ratón a 2,5 μg/ml de concentración final en 50 μl de tampón PBS/BSA/EDTA por muestra. Posteriormente, agregue 50 μl de anticuerpos contra MHC-II (I-A/I-E), CD11c y Gr-1 conjugados con diferentes fluorocromos a 1:100, 1:200 y 1:500 en tampón PBS/BSA/EDTA, respectivamente.
      2. Finalmente, lave las CD con tampón PBS/BSA/EDTA y analice mediante citometría de flujo según el protocolo del fabricante.
         Nota: Si las células están bien diferenciadas, están listas para la carga de antígenos.
   3. Lavar las CD con RPMI 10% FBS (sin antibióticos) e incubarlas con 10 μg/ml de péptido OTII de ovoalbúmina (OVAp) (OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E A G R) en un tubo de plástico en 1 ml de medio RPMI 10% FBS por 5 x 10⁶ CD durante un mínimo de 1 hora a 37 ºC. Como control negativo, deje las CD sin incubar con OVAp.
3. Infección de CD
   1. Infecte las CD a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 bacterias (10 bacterias por CD) durante 1 hora en una incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO₂).
   2. Lavar las células DC 3x en PBS y 1x en RMPI 10% FBS y centrifugar a 450 x g para lavar la mayoría de las bacterias extracelulares. Finalmente, resuspender las células en medio RMPI 10% FBS (sin antibióticos) a 20 x 10⁶ células/ml.

2. Aislamiento de linfocitos T CD4⁺ de ratones transgénicos OTIINOTA: La Figura 1 resume este segundo paso. Se deben usar ganglios linfáticos en lugar del bazo para aislar las células T CD4⁺ , porque la proporción de linfocitos CD4⁺ en los ganglios linfáticos (~50%) es mayor que en el bazo (~25%) y, por lo tanto, la purificación sería más efectiva.

1. Hacer una suspensión unicelular de los ganglios linfáticos
   1. Retire los ganglios linfáticos inguinales, axilares, braquiales, cervicales y mesentéricos de ratones transgénicos OTII y transfiéralos a un plato de plástico con 10 ml de medio RPMI 10% FBS.
   2. Muela los ganglios linfáticos bajo una capucha estéril con dos portaobjetos de microscopio esmerilado. Coloque los ganglios linfáticos en un lado esmerilado de un portaobjetos de microscopio y frote con el lado esmerilado del segundo portaobjetos hasta que los órganos hayan sido molidos.
   3. Lave la suspensión de una sola célula en tampón PBS/BSA/EDTA.
   4. Filtre las células a través de un filtro celular (70 μm) para eliminar el tejido conectivo y lávelas con tampón PBS/BSA/EDTA.
   5. Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lisis ACK e incube durante 1 min a RT para eliminar los glóbulos rojos.
2. Aislamiento de células T CD4⁺
   1. Lavar de nuevo como en el paso 2.1.3 y contar las células para volver a suspenderlas a 100 x 10⁶ células /ml en tampón PBS/BSA/EDTA. Agregue anticuerpos biotinilados contra CD8, IgM, B220, CD19, MHC clase II (I-Ab), CD11b, CD11c y DX5 a 1:250 durante 30 min en hielo para una posterior selección negativa de células T CD4⁺ .
   2. Lave las células en tampón PBS/BSA/EDTA e incube las células (100 x 10,⁶ células/ml) con microperlas de estreptavidina a la concentración recomendada en el protocolo del fabricante durante 15 min con hielo.
   3. Lave las células en tampón PBS/BSA/EDTA y fíltrelas a través de un filtro celular (30 μm) antes del aislamiento de células T CD4⁺ .
   4. Aísle las células T CD4⁺ mediante selección negativa utilizando una máquina de separación celular magnética según el protocolo del fabricante.
   5. Cuente las células y ajuste a 4 x 10⁶ células/ml con medio RPMI 10% FBS (sin antibióticos).
   6. Fije y mantenga en hielo las células T CD4⁺ aisladas (3 x 10⁵ células) para verificar la pureza mediante un citómetro de flujo. En la Figura 3C se muestra un ejemplo de purificación de células T CD4⁺.

3. Medición de la transinfección de células T mediante ensayo de protección con gentamicinaNota: La Figura 2 resume este tercer paso del protocolo.

1. Transinfección de células T

1. Incubar células T CD4⁺ aisladas con células DC infectadas (1:1) (las DC se infectaron durante 1 hora y se lavaron para eliminar las bacterias libres) durante 30 min para permitir la formación de sinapsis inmunes en una incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO₂).

2. Agregue 0,5 ml de células T CD4⁺ aisladas (2 x 10⁶ células) y 0,1 ml de CD infectadas (2 x 10⁶ células) en una placa de cultivo de 24 pocillos. Como control negativo, infectar directamente 0,5 ml de células T CD4⁺ a un MOI de 10 bacterias durante 30 min.

3. Incluya controles adicionales que separen las CD infectadas de las células T utilizando una barrera transpocilla de policarbonato (con 3 μm de tamaño de poro), impidiendo el contacto físico DC-T. Agregue 0,1 ml de CD dentro del transpocillo y 0,5 ml de células T CD4⁺ en el compartimento inferior del pocillo (placa de 24 pocillos).

4. Finalmente, completar con medio RMPI hasta que haya 0,6 ml en cada pocillo para hacer volúmenes iguales en todas las muestras.

5. Después de 30 min de formación de sinapsis inmune, agregue 100 μg / ml de gentamicina e incube durante 1 hora antes de recolectar células en una incubadora de CO₂ (37 ° C, 5% CO₂).

Resultados

Figura 1. Diagrama de flujo de generación de CC y aislamiento de células T CD4⁺ . En el lado izquierdo de la figura, se detalla el proceso para diferenciar las células dendríticas (DC) de las células de la médula ósea. Después de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI	Fisher Scientific	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Piruvato de Na	Thermo Scientific	SH3023901
2-YO	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323-339)	GenScript	---
Filtro de Células 70uM	BD	352350
Jeringa 30uM Filcons Estéril	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicina	Normon	624601.6
Transwell	Coprotagonista	3415
LB	Pronadisa	1231
Agar-agar	Pronadisa	1800
Paraformaldehído 16%	Ciencias de la microscopía electrónica	15710
Tritón X-100
Biografía CD8	BD Biociencias	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Clonar RMM-1
B220 Biot	BD Biociencias	553086
Biografía CD19	BD Biociencias	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biociencias	553622
Biografía CD11b	Immunostep	11BB-01mg
Biografía CD11c	Immunostep	11CB3-01mg
Biografía DX5	BD Biociencias	553856
Gr-1 biot	BD Biociencias	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biociencias	553802
CD4-APC	Biociencias de Tonbo	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biociencias	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biociencias	553623
Alexa-Fluor 647 Anticuerpo IgG (H+L) anti-conejo de cabra, altamente adsorbido	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-clorometilcumarina)	Tecnologías de la vida	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Microperlas de estreptavidina	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biociencias	---