Ensayo de fototaxis de cianobacterias filamentosas utilizando iluminación de luz focalizada

En este artículo

Resumen

Fuente: Weber, N. et. al., Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la cianobacteria filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra un ensayo basado en LED enfocado para estudiar la fototaxis en cianobacterias filamentosas. Las bacterias migran hacia la fuente de luz, formando una densa acumulación en el centro iluminado, que se visualiza y cuantifica mediante el análisis de intensidad de píxeles de la imagen capturada.

Protocolo

Ensayo para fototaxis
1. Para los experimentos de fototaxis, prepare soportes de diodos emisores de luz (LED) (aquí, con una impresora 3D) en los que los LED de 5 mm seleccionados se montan para irradiar un área de 20 mm² de abajo hacia arriba (Figura 1). Si es necesario, utilice muchos soportes de LED en paralelo, conectando cada LED eléctricamente a través de una resistencia y un potenciómetro a una fuente de alimentación ajustable. Mida y ajuste las intensidades de los LED, según el experimento. Asegúrese de que todo el entorno esté en una habitación oscura o en un recipiente cerrado y oscuro.
2. Coloque 8 ml del medio que contiene Phormidium lacuna en una placa de Petri de 6 cm. Ajuste la intensidad de la luz del LED. Cierre la placa de Petri con la tapa y colóquela en un soporte de LED para que el LED quede en el centro de la placa de Petri.
3. Después de la duración deseada (generalmente 2 días), capture una imagen de la placa de Petri con la cámara de un teléfono inteligente dirigida directamente a la posición del tratamiento de luz. Utilice un panel LED blanco para la irradiación de la muestra. Utilice la configuración manual de la cámara; evitar los reflejos de la luz; Ajuste siempre para obtener la misma distancia entre la lente de la cámara y la muestra. Asegúrese de que los ajustes de exposición proporcionen una imagen adecuada para análisis posteriores con ImageJ.
4. Cuantifique el diámetro del círculo central de filamentos utilizando el software ImageJ.
  1. Abra ImageJ, haga clic en Archivo | Abra, seleccione el archivo deseado y haga clic en Entrar.
  2. Seleccione el botón Recto (con una línea recta). Presione el botón izquierdo del mouse para dibujar una línea desde un extremo de la placa de Petri hasta el extremo opuesto. Asegúrese de que la línea pase por el centro del círculo de filamentos.
  3. Presione Ctrl-K en el teclado o haga clic en Analizar | Trazar perfil en el menú ImageJ. Busque una ventana x-y con intensidades de píxeles trazadas frente a la distancia: un perfil 1D de la placa de Petri. Asegúrese de que la intensidad de píxel más baja esté ligeramente por encima de 0 y el valor más alto esté por debajo de 255.
  4. Calcule un valor promedio para la intensidad de píxeles fuera del círculo y otro valor promedio para la intensidad de píxeles en el círculo. En la posición y entre estos valores, estime los valores x de ambos lados del círculo apuntando con el mouse a estas posiciones. Anote ambos valores y calcule la diferencia.
  5. Obtenga el valor x más alto apuntando el mouse al eje y a la derecha. Tenga en cuenta que este valor e representa el diámetro de la placa de Petri. Si este diámetro es de 5 cm, calcule el diámetro del círculo central del filamento como d/e × 5 cm.

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Resultados

Figura 1: Experimento de fototaxis. Izquierda: Soporte de LED con 4 LED rojos, conectado a una fuente de alimentación ajustable. En la parte superior de cada LED, hay una placa de Petri de 6 cm con 8 ml de cultivo de Phormidium lacuna. Derecha: Placa de P...