Evaluación de la unión neumocócica a células endoteliales humanas primarias bajo flujo constante de medios

Resumen

Fuente: Jagau, H. et al. Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la visualización en tiempo real de la unión neumocócica a las cadenas del factor de von Willebrand (VWF) en células endoteliales en condiciones de flujo de medios constantes. Describe los pasos para estimular la liberación de VWF, etiquetar las cuerdas y cuantificar la unión bacteriana.

Protocolo

1. Inducción de la liberación del factor de von Willebrand (VWF) y visualización de cadenas de VWF multimerizadas

1. Mantenga el ajuste de flujo porque se requiere un esfuerzo cortante de 10 dyn/cm² para desencadenar la multimerización de VWF a cadenas largas de hasta 200 MDa. Induzca la liberación de VWF del WPB endotelial inyectando 136 μL de una solución madre de histamina de 100 mM en el medio de crecimiento de células endoteliales con mezcla de suplementos (ECGMS)-medio que circula en el tubo de perfusión utilizando un puerto de inyección. La concentración final de histamina en el medio de flujo será de 1 mM. Si no hay un puerto de inyección disponible, la histamina se puede agregar alternativamente pipeteando en el medio de los depósitos de la bomba.
2. Para la detección de inmunofluorescencia de cadenas de VWF multimerizadas, detenga el flujo cuando se alcance un nivel de medio equilibrado en los reservorios e inyecte 20 μg de un anticuerpo conjugado con isotiocianato de fluoresceína específico de VWF (FITC) en un volumen de 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) en los 13,6 ml circulantes de medio ECGMS utilizando un puerto de inyección. Si no hay un puerto de inyección disponible, el anticuerpo se puede agregar alternativamente pipeteando en el medio de los depósitos de la bomba. Esto da como resultado una concentración final de anticuerpos de 1,3 μg/ml.
3. Para el escaneo microscópico de varios campos de visión en poco tiempo, utilice la unidad de fluorescencia del microscopio con un dispositivo de fluorescencia de xenón al 30% de potencia y una cámara de epifluorescencia. Monitoree la forma y la morfología de la capa de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con el modo de campo claro para seleccionar células representativas adecuadas para la visualización de cadenas de VWF.
4. Para la visualización de cadenas de VWF fluorescentes verdes, seleccione un objetivo de aceite de 63x/1,40 y un filtro de detección de 470 nm en el menú de la unidad de fluorescencia del software del microscopio (LasX). Cree instantáneas de pilas Z de al menos 50 vistas de campo representativas, cada una de las cuales contiene aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactos. Para la cuantificación de las cadenas de VWF fluorescentes verdes en diferentes puntos de tiempo, escanee varios campos de visión.

2. Evaluación microscópica de la unión bacteriana a las cadenas de VWF en flujo en tiempo real

1. Cuantifique la unión neumocócica a las cadenas de VWF generadas en las superficies celulares de HUVEC mediante detección de inmunofluorescencia.
   1. Mantenga el flujo e inyecte neumococos que expresan proteína de fluorescencia roja (RFP) de 1,35 x 10⁸ UFC/ml en un volumen máximo de 1 ml en el medio ECGMS utilizando el puerto de inyección. Alternativamente, pipetee las bacterias en el medio en el depósito de la bomba. Reinicie el esfuerzo cortante a 10 dyn / cm² para permitir que las bacterias circulen dentro del sistema de bomba.
   2. Seleccione un objetivo de inmersión en aceite de 63x para el aumento del microscopio y ajuste la configuración del filtro de fluorescencia en el software del microscopio al canal RFP (filtro de detección de 540 nm) para la detección de neumococos que expresan RFP.
   3. Para cuantificar la unión bacteriana a las cadenas de VWF, detenga el flujo y cree instantáneas de pilas Z de al menos 30 vistas de campo representativas, cada una con aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactos, y cuente el número de neumococos.
   4. Utilice el algoritmo estadístico de un factor ANOVA para evaluar los datos, seguido de una prueba de muestra no apareada de dos colas post hoc para una comparación estadística detallada. Los valores de p de <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Materiales