Imágenes de fluorescencia de infección bacteriana asociada a biomateriales en embriones de pez cebra

Resumen

Fuente: Zhang, X., et al. Un modelo de embrión de pez cebra para la visualización in vivo y el análisis intravital de la infección por Staphylococcus aureus asociada a biomateriales. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra imágenes de fluorescencia de embriones de pez cebra inyectados con Staphylococcus aureus, lo que permite cuantificar la progresión de la infección y la distribución bacteriana para evaluar el impacto de las microesferas de biomateriales en las interacciones huésped-patógeno in vivo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Microscopía de fluorescencia de la progresión de la infección e infiltración celular provocada en embriones de pez cebra

1. Anestesiar los embriones colocándolos en una placa de Petri de 100 mm que contenga 0,02% (p/v) de ácido 3-aminobenzoico (Tricaína) para anestesiarlos. Después de 5 min, transfiera los embriones a la placa de agarosa recubierta con medio E3 que contiene 0,02% (p/v) de tricaína y alinéelos en una orientación para la inyección. Pipetear 500 μL de una solución de metilcelulosa PBS (solución salina tamponada con fosfato) al 2% (p) en una placa de Petri que contenga medio E3 con 0,02% (p/v) de tricaína. Coloque los embriones en la solución de metilcelulosa y manténgalos rectos y horizontales.
   NOTA: La solución de metilcelulosa se usa como "pegamento", que debido a su viscosidad, puede inmovilizar temporalmente los embriones en la mejor orientación para la obtención de imágenes.
2. Utilice un microscopio de fluorescencia estereoscópica equipado con filtros de campo claro, mCherry, proteína fluorescente verde (GFP) y UV (ultravioleta) para obtener imágenes de embriones individuales con configuraciones optimizadas idénticas (por ejemplo, intensidad, ganancia y tiempo de exposición) con un aumento de 160x. Ajuste el plano focal de modo que el daño tisular causado por la inyección esté enfocado, utilizando el filtro de campo claro. Establezca la profundidad de la pila Z en 10 μm y el tamaño del paso en 5 μm, lo que permite la grabación de 3 imágenes consecutivas.
3. Imágenes de embriones individuales una vez al día desde 5 h después de la inyección hasta 2 días después de la inyección. Excluir embriones muertos (sin latidos del corazón o embrión parcialmente degradado) para obtener más imágenes y análisis. Mantenga los embriones individualmente en medio E3 en placas de 48 pocillos. Refresca el medio diariamente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microesferas de poliestireno de 10 μm de diámetro (azul fluorescente)	Tecnología de vida/ThemoFisher	F8829
Ácido 3-aminobenzoico (Tricaína)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Microscopio fluorescente estereoscópico LM80	Leica	MDG3610450126
Metilcelulosa 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Placa de Petri	Halcón	353003
Placa de Petri	Biomerieux	NL-132
ImagenJ	No aplicable	No aplicable	enlace: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0	Prisma	No aplicable