Análisis in vivo de infecciones bacterianas asociadas a implantes utilizando embriones de pez cebra

Resumen

Fuente: Zhang, X. et. al., Un modelo de embrión de pez cebra para la visualización in vivo y el análisis intravital de la infección por Staphylococcus aureus asociada a biomateriales. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra un modelo de embrión de pez cebra para estudiar infecciones relacionadas con biomateriales implantados. La inyección de microesferas de poliestireno de Staphylococcus aureus mejora la supervivencia bacteriana, lo que confirma el papel promotor de infecciones de los materiales implantados.

Protocolo

1. Preparación de suspensiones solo para bacterias y microesferas para bacterias

NOTA: Se utiliza la cepa de Staphylococcus aureus RN4220 que expresa la proteína fluorescente mCherry (S. aureus-mCherry). La cepa S. aureus RN4220 está mutada en el gen regulador de virulencia agrA (regulador del gen accesorio A) y, por lo tanto, puede tener una virulencia relativamente baja en el modelo de embrión de pez cebra. Se pueden utilizar otras cepas de S. aureus u otras especies bacterianas para la infección asociada a biomateriales (BAI).

1. Tomar de 4 a 5 colonias de bacterias S. aureus RN4220 de placas de cultivo de agar de soja tríptico suplementadas con 10 μg/mL de cloranfenicol y cultivar la bacteria hasta la fase de crecimiento logarítmico medio en 10 mL de caldo de soja tríptico suplementado con 10 μg/mL de cloranfenicol a 37 °C bajo agitación.
   1. Durante el cultivo, diluir 100 μL de la suspensión bacteriana en 900 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una cubeta (ancho de 1 cm) para una medición de densidad óptica (OD) a 620 nm (OD₆₂₀). Cultive las bacterias hasta que el OD₆₂₀ alcance 0,4-0,8.
      NOTA: Un DO₆₂₀ de 0,1 generalmente corresponde a 3,0 x 10⁷ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml de S. aureus. El OD₆₂₀ de un inóculo de bacterias en la fase de crecimiento logarítmico medio está entre 0,4-0,8. Es posible que se necesiten diferentes períodos de tiempo para el cultivo para otras especies y cepas de bacterias.
2. Centrifugar bacterias a 3.500 x g durante 10 min y resuspender las bacterias granuladas en 1 mL de PBS estéril. Posteriormente, lave las bacterias con PBS estéril 2 veces y finalmente vuelva a suspender las bacterias en 1,1 ml de solución de polivinilpirrolidona al 4% (p/v) (PVP40) en PBS.
3. Agite esta suspensión bacteriana y diluya 100 μL de la suspensión en 900 μL de PBS estéril en una cubeta para la medición de OD₆₂₀ . Ajuste la concentración de la suspensión bacteriana con la solución PVP40. Esta es la suspensión "solo para bacterias".
4. Los biomateriales se pueden elegir libremente para mezclarse con la suspensión bacteriana. En el presente estudio, se utilizan microesferas comerciales de poliestireno (PS) (fluorescentes azules, 10 μm). Para generar una suspensión bacteria-Microesferas, centrifugar las microesferas durante 1 min a 1.000 x g, temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y volver a suspender las microesferas en la suspensión "Solo bacterias" (en solución PVP40).
5. Para inyectar dosis aproximadamente iguales de bacterias en presencia y en ausencia de microesferas, la concentración de la suspensión de bacterias-microesferas debe ser dos tercios de la concentración de la suspensión "solo bacterias" (sin microesferas). Esto se logra diluyendo la suspensión Bacteria-Microspheres con 0,5 volumen de solución de PVP40. Mezclar las suspensiones por vórtice. Cabe destacar que esta proporción (dos tercios) se ha evaluado para S. aureus. También es apropiado para S. epidermidis, pero se recomienda verificar si esta proporción también se aplica a otras especies bacterianas y otros tamaños (que no sean 10 μm) o formas de biomateriales (que microesferas) que se inyectarán.
6. Verifique la concentración de la suspensión "Solo bacterias" y Bacterias-microesferas mediante cultivo cuantitativo de diluciones seriadas de 10 veces como se muestra a continuación: transfiera 100 μL de las suspensiones a una placa de 96 pocillos y diluya en serie transfiriendo 10 μL de alícuotas de la suspensión a 90 μL de PBS estéril. Duplicar 10 μL de alícuotas de las suspensiones diluidas y sin diluir en placas de agarosa, incubar las placas a 37 °C durante la noche, contar las colonias y calcular el número de bacterias (unidades formadoras de colonias, UFC).

2. Cría, recolección y mantenimiento de embriones de pez cebra

1. Siga los procedimientos generales para la reproducción, recolección y mantenimiento de embriones de pez cebra, con las modificaciones que se describen a continuación. Cruce una familia de peces cebra de aleta larga (TL) de tipo salvaje o pez cebra de la línea transgénica seleccionada (aquí, Mpeg1: Kaede) en un tanque con una red agregada para inducir a las hembras adultas a producir huevos después de que se encienda la luz, luego separe a los adultos de los huevos producidos.
2. Al día siguiente, recoge los embriones y desecha los no transparentes, que no son viables. Mantener aproximadamente 60 embriones por placa de Petri (100 mm de diámetro) en medio E3 e incubar a 28 °C. Retirar los embriones muertos y anormales y refrescar el medio E3 diariamente.

3. Preparación de agujas de inyección

1. Prepare las agujas microcapilares de vidrio para inyectar con un instrumento extractor de micropipetas. Utilice los siguientes ajustes: calor: 772, tirón: 100, vel: 200, tiempo: 40, gas: 75.
2. Romper la punta de la aguja con unas pinzas en la posición donde la aguja tiene un diámetro exterior de aproximadamente 20 μm (para microesferas de 10 μm), utilizando un microscopio óptico con una barra de escala en el ocular. Evite las agujas con un tamaño de abertura muy grande, ya que comprometerán la supervivencia de los embriones.
   NOTA: La abertura puede elegirse para ser más pequeña o más grande, dependiendo del tamaño y la forma de los biomateriales a inyectar. En la literatura, se ha informado que las inyecciones con agujas con una abertura de aproximadamente 50 μm causan una disminución significativa en la supervivencia del embrión.

4. Inyección de suspensión de microesferas de bacterias o bacterias en embriones de pez cebra

1. Calentar la solución de agarosa (1-1,5% (peso) en demi-agua) en un horno microondas y verter en una placa de Petri de 100 mm. Coloque una plantilla de molde de plástico encima de la solución de agarosa en la placa de Petri para crear hendiduras en la agarosa para colocar los embriones en las posiciones adecuadas y facilitar las inyecciones. Incubar a temperatura ambiente y retirar el molde cuando la solución de agarosa se haya solidificado.
2. A los 3 días después de la fertilización, coloque los embriones en una placa de Petri de 100 mm que contenga 0,02% (p / v) de ácido 3-aminobenzoico (Tricaína) para anestesiarlos. Después de 5 min, transfiera los embriones a la placa de agarosa recubierta con medio E3 que contiene 0,02% (p/v) de tricaína y alinéelos en una orientación para la inyección. Para la línea transgénica Mpeg1: Kaede, primero anestesia embriones en medio E3 que contiene 0,02% (p/v) de tricaína. Luego, seleccione embriones que expresen proteínas fluorescentes verdes usando un microscopio de fluorescencia estereoscópica.
3. Cargue la aguja con aproximadamente 10 μl de la suspensión "Solo bacterias" o Microesferas bacterianas con una punta de pipeta de microcargador. Monte la aguja en un micromanipulador conectado al microinyector. Para el inyector utilizado aquí (consulte la tabla de materiales), use los siguientes ajustes para inyecciones de 2-3 nL: presión: 300-350, contrapresión: 0, tiempo: 2 ms. NOTA: La configuración del microinyector depende del inyector utilizado. Es posible que sea necesario ajustar la configuración del inyector para inyecciones de bacterias mezcladas con biomateriales con otras formas o tamaños.
   1. Utilice agujas con la misma abertura para la inyección de la suspensión "Bacteria-only" y la suspensión Bacteria-Microspheres. Si la aguja está rota u obstruida, siempre cambie por una aguja nueva para recibir más inyecciones.
4. Inserte la aguja en el tejido muscular de los embriones bajo un microscopio óptico (Figura 1), en un ángulo de 45 a 60 ° entre la aguja y el cuerpo de los embriones. Ajuste la posición de la aguja en el tejido moviéndola suavemente hacia adelante y hacia atrás. Inyecte los embriones con un pedal conectado al microinyector.
5. Después de la inyección de bacterias fluorescentes, marque los embriones para una infección exitosa bajo un microscopio de fluorescencia estereoscópica. Deseche los embriones puntuados negativos (sin bacterias fluorescentes visibles o sin microesferas fluorescentes visibles). Mantenga los embriones individualmente en medio E3 en placas de 48 pocillos. Refresca el medio diariamente.

5. Trituración de embriones, puntuación microscópica y cultivo cuantitativo de bacterias

1. Califique todos los embriones microscópicamente para detectar la presencia de bacterias fluorescentes utilizando un microscopio de fluorescencia estereoscópica, comenzando inmediatamente después de las inyecciones y en cada día posterior hasta que los embriones se seleccionen al azar para el cultivo cuantitativo.
2. Seleccione al azar algunos embriones vivos infectados (5 a 6 en el presente estudio) poco después de la inyección y transfiéralos individualmente a microtubos separados de 2 ml utilizando puntas estériles. Retirar el medio, lavar los embriones suavemente con PBS estéril una vez y añadir 100 μL de PBS estéril.
3. Agregue 2-3 perlas de zirconio estériles (2 mm de diámetro) a cada vial y triture los embriones con el homogeneizador (consulte la tabla de materiales) a 3.500 rpm durante 30 s. Cultive el homogeneizado cuantitativamente como se describe en el paso 1.3.
   NOTA: Otros homogeneizadores pueden requerir diferentes ajustes.
4. Seleccione aleatoriamente varios embriones en los días posteriores a la inyección para un cultivo cuantitativo de acuerdo con el paso 5.3.

Resultados

Figura 1: Procedimiento esquemático de coinyección de suspensión de bacterias-microesferas en el músculo de la cola de embriones de pez cebra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar tríptico de soja	BD Difco	236950	Unidad de preparación de medios en AMC
Caldo de soja tríptico	BD Difco	211825
Polivinilpirrolidona40	Aplicar	A2259.0250
Microesferas de poliestireno de 10 μm de diámetro (azul fluorescente)	Tecnología de vida/ThemoFisher	F8829
Vidrio microcapilar (1 mm de diámetro exterior x 0,78 mm de diámetro interior)	Aparato de Harvard	30-0038
Extractor de micropipetas	Instrumento Sutter Inc	Flaming p-97
Microscopio óptico LM 20	Leica	ODM33 10450123
Ácido 3-aminobenzoico (Tricaína)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Agarose MP	Roche	11388991001
Microscopio fluorescente estereoscópico LM80	Leica	MDG3610450126
Puntas de pipeta Microloader	Eppendorf	5242956.003
Micromanipulador M3301 con soporte M10	Instrumentos de precisión del mundo	00-42-101-0000
Microinyector FemtoJet express	Eppendorf	5248ZO100329
Microtrube 2ml pp	Sarstedt	72.693.005
Cuentas de circonio	Bio-conectar	11079124ZX
Lyser MagNA	Roche	41416401
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Agitador giroscópico (para el crecimiento bacteriano)	Nuevo Brunswick Científico	G10
Incubadora de pez cebra	VWR	Línea Incu-line
Cubetas	MARCA	759015
Centrífuga	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
Espectrómetro	Farmacia biotecnológica	Ultrospec®2000
Fórceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 placas de pocillos	Greiner bio-one	677180
96 placas de pocillos	Greiner bio-one	655161
Placa de Petri	Halcón	353003
Placa de Petri	Biomerieux	NL-132