Preparación de un inóculo bacteriano unicelular

Resumen

Fuente: Niu, L., et al., Visualización de la muerte de células líticas de macrófagos durante la infección por micobacterias en embriones de pez cebra mediante microscopía intravital. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la preparación de una suspensión unicelular de Mycobacterium marinum a partir de un cultivo de fase logarítmica tardía para un uso consistente en ensayos de infección y aplicaciones posteriores.

Protocolo

1. Preparación de inóculo unicelular de Mycobacterium marinum (Figura 1)

1. Descongele el stock de glicerol de Mycobacterium marinum cerúleo-fluorescente a -80 °C e inocule una placa de agar 7H10 con 10% (v/v) de OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa), 0,25% de glicerol y 50 μg/mL de higromicina. Incubar la placa a 32 °C durante unos 10 días.
2. Seleccione una colonia que exprese fluorescencia positiva e inocule 3 ml de medio 7H9 con 10% de OADC, 0,5% de glicerol y 50 μg/ml de higromicina.
   1. Incubar la inoculación a 32 °C y 100 revoluciones por minuto (rpm) durante 4-6 días hasta que el cultivo alcance la fase logarítmica (DO₆₀₀ = 0,6-1,0).
   2. Subcultivo (1:100) en 30 mL de medio 7H9 fresco con 10% de OADC, 0.5% de glicerol, 0.05% de Tween-80 y 50 μg/mL hasta que el OD₆₀₀ alcance ~1.0.
      NOTA: En este punto, se recomienda un paso de subcultura para obtener la máxima calidad de cultivo. En nuestra experiencia, agregar el clon directamente a un gran volumen de medio conducirá a la formación de grumos bacterianos.
3. Recoja las células de M. marinum como se describe a continuación.
   1. Centrifugar a 3.000 x g durante 10 min para recoger el M. marinum en forma de pellet. Deseche todo menos 300 μL del sobrenadante y utilícelo para resuspender el sedimento.
   2. Añadir 3 ml de medio 7H9 con glicerol al 10% para resuspender aún más el gránulo, luego sonicar la suspensión en un baño de agua a 100 W a 15 s ON, 15 s OFF durante un total de 2 min.
      NOTA: La sonicación se utiliza para conseguir un homogeneizado unicelular para el inóculo, lo que evita que la aguja de microinyección se bloquee.
4. Transfiera la suspensión bacteriana a una jeringa de 10 ml y pásela por un filtro de 5 μm para eliminar los grumos.
5. Mida la densidad óptica (OD) de la suspensión con un espectrofotómetro y dilúyala a OD₆₀₀ = 1,0 con medios 7H9 que contengan un 10% de glicerol. Divida la suspensión en alícuotas de 10 μL y guárdela a -80 °C en el congelador para su uso futuro.
6. Confirme la concentración bacteriana del inóculo (ufc/ml) mediante dilución en serie y siembra del stock bacteriano en una placa de agar 7H10 que contenga 10% (v/v) de OADC, 0,5% de glicerol y 50 μg/ml de higromicina.

Resultados

Figura 1: Diagrama esquemático de la preparación de bacterias unicelulares. Se generaron poblaciones unicelulares de Mycobacterium marinum fluorescentes cerúleas siguiendo el proceso descrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,05% Tween-80	Sigma	P1379
Jeringa de 10 ml	Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
Filtro de 5 μm	Mille X	SLSV025LS
50 μl/ml de higromicina	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
Cámara Ambiental	Pecon	Control de temperatura 37-2 digital
Microcargador Eppendorf	Eppendorf	No.5242956003
Glicerol	Sangon Biotech	A100854
Incubadora	Keelrein	PH-140 (A)
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
Sonicador	SCICNTZ	JY92-IIDN
Espectrofotómetro (OD600)	Eppendorf AG	22331 Hamburgo