Obtención de amiloides citotóxicos después de la infección bacteriana de las células endoteliales pulmonares de rata

En este artículo

Resumen

Fuente: Balczon, R., et al. Métodos para detectar amiloides citotóxicos después de la infección de células endoteliales pulmonares por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el procedimiento para generar sobrenadante citotóxico a partir de células endoteliales pulmonares después de la infección por Pseudomonas aeruginosa. Describe cómo las proteínas efectoras bacterianas alteran la estructura de la célula huésped e inducen la liberación de oligómeros amiloides citotóxicos en el sobrenadante.

Protocolo

Generación de sobrenadantes citotóxicos:

Se obtuvieron cultivos primarios de células endoteliales microvasculares pulmonares (PMVEC) de rata en la Instalación Central de Cultivos Celulares del Centro de Biología Pulmonar de la Universidad del Sur de Alabama.

Para la generación de sobrenadantes citotóxicos, coloque 2 x 10⁶ células en placas individuales de 150 cm y crezca durante 3 a 4 días hasta lograr la confluencia. Use dos placas por experimento.
Para producir sobrenadante, lave una de las dos placas de 150 cm de PMVEC con solución salina tamponada con fosfato, tripsinice y luego cuente las células. Lave el otro plato de PMVEC con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y luego infecte con cualquiera de las cepas de Pseudomonas aeruginosa en una multiplicidad de infección (MOI) de 20: 1. Esto se logra de la siguiente manera:
1. Para P. aeruginosa, DO₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ UFC/ml. Para preparar esta dilución, agregue 1 ml de HBSS a una cubeta desechable de 1 ml. Raspe suficientes bacterias de la placa hasta que se logre un OD₅₄₀ de 0.25 cuando se mide con un espectrofotómetro. El siguiente paso proporcionará un cálculo de la cantidad de bacterias que se necesitarán.
2. Una vez que se determina el número de PMVEC en la placa de cultivo, determine el número apropiado de bacterias que se agregarán a la segunda placa de cultivo no tripsinizada que contiene las PMVEC. Por ejemplo, si se determina que la placa de cultivo de PMVEC contiene 1,3 x 10⁷ células, entonces prepare 1,3 x 10⁷ células x 20 bacterias/célula x 1 ml/2 x 10⁸ UFC = 1,3 ml de bacterias.
3. Diluya los 1,3 ml de bacterias en HBSS hasta un volumen final de 20 ml, de modo que toda la superficie de un plato de 150 cm pueda cubrirse con líquido, luego agregue las bacterias diluidas a la placa de PMVEC.
4. Incubar los PMVEC inoculados con las bacterias a 37 °C en una incubadora de_CO2al 5% durante 4 a 5 h, hasta que se puedan ver huecos formados en la monocapa celular cuando se observa la placa al microscopio (ver Figura 1 para el nivel adecuado de formación de huecos).
5. Recoja el sobrenadante, luego centrifugue durante 10 min a 2,000 x g en una centrífuga de mesa para eliminar los desechos celulares.
  Nota: Para este paso se puede utilizar cualquier centrífuga de mesa capaz de generar suficiente fuerza g para granular células no lisadas y fragmentos de células grandes.
6. Vierta el sobrenadante en una jeringa que tenga un filtro de 0,2 μm conectado a su extremo, luego pase el sobrenadante a través del filtro para eliminar las bacterias.
7. Utilizar una alícuota del sobrenadante estéril para probar la citotoxicidad y congelar el resto del sobrenadante a -80 °C para su uso futuro.

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Resultados

Figura 1. Efectos de la inoculación de P. aeruginosa sobre la morfología de PMVEC. Una monocapa confluente de PMVEC antes (A) y cuatro horas después de la adición (B) de la cepa PA103 de P. aeruginosa. Se pueden ver claramente bre...